李軍+宋光明+孫明林++黃揆++張春秋+付浩++李瑞欣++張西正

[摘要] 目的 體外模擬成骨細(xì)胞在體內(nèi)的生存環(huán)境，探討淫羊藿苷（ICA）對高重力下成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖與凋亡的影響。 方法 將成骨細(xì)胞隨機(jī)分為三組：高重力組、高重力+ICA組（以下簡稱“聯(lián)合組”）和對照組，其中，高重力組予以20G高重力，聯(lián)合組將20G高重力和10 μg/L ICA同時應(yīng)用于細(xì)胞，對照組正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何附加操作。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞凋亡，實(shí)時定量PCR（qRT-PCR）檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，透射電鏡（TEM）檢測細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果 MTT法檢測顯示，高重力組吸光度值顯著低于對照組（P < 0.01），聯(lián)合組吸光度值顯著高于對照組和高重力組（P < 0.01）。FCM檢測顯示，高重力組凋亡率顯著高于對照組（P < 0.01），聯(lián)合組凋亡率顯著低于對照組和高重力組（P < 0.01）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，高重力組Bax、Bcl2、Bax/Bcl2、P53的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（P < 0.01或P < 0.05），聯(lián)合組除Bax/Bcl2 mRNA表達(dá)外均顯著下調(diào)（P < 0.05或P < 0.01），且聯(lián)合組Bax、Bcl2、Bax/Bcl2、P53的mRNA表達(dá)均顯著低于高重力組（均P < 0.01）。TEM下可見高重力組呈中晚期凋亡和變性壞死現(xiàn)象，而其他兩組無明顯變化。 結(jié)論 成骨細(xì)胞可響應(yīng)高重力刺激信號并發(fā)生一系列變化；高重力（20G）不僅可抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可導(dǎo)致成骨細(xì)胞發(fā)生變性壞死，但適當(dāng)濃度（10 μg/L）的ICA可逆轉(zhuǎn)高重力加載所導(dǎo)致的這種不利影響，對成骨細(xì)胞起相應(yīng)的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 成骨細(xì)胞；淫羊藿苷；高重力；增殖；凋亡

[中圖分類號] R681 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0019-05

淫羊蕾又名放杖草、千兩金、三枝九葉草等，為小檗科淫羊藿屬的多種植物的干燥地上部分。《本草綱目》記載其有“益糟氣，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力”的功效?，F(xiàn)代中藥藥理學(xué)認(rèn)為淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿的主要有效成分之一，能增加心腦血管血流量、免疫功能及骨代謝[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ICA可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)成骨活性，促進(jìn)骨形成[2-3]。錢衛(wèi)慶等[4]發(fā)現(xiàn)濃度為10 μg/L的ICA可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其成骨能力。本課題組在之前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)20G的高重力條件可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡并出現(xiàn)變性壞死的現(xiàn)象[5]。然而，很少研究集中在ICA與高重力刺激相結(jié)合時對成骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響。因此，本研究旨在探討ICA聯(lián)合高重力對成骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為骨相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞系由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

ICA（CAS：489-32-7，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司KGA107）；Trizol試劑（Invitogen，美國）；qPCR試劑盒（InvitogenC11733038，美國）；離心式高加速度加載機(jī)（天津理工大學(xué)）；酶標(biāo)儀（TECANInfinite 200Pro，瑞士）；Bio-rad實(shí)時定量PCR儀（Bio-RadIQ5，美國）；流式細(xì)胞儀（Beckman J6HC，美國）；透射電鏡（HT7700，日本）。

1.3 方法

采用課題組特殊設(shè)計(jì)的離心式高加速度加載機(jī)，使之能匹配培養(yǎng)瓶一起固定于轉(zhuǎn)子體對應(yīng)的凹槽內(nèi)，相對高重力RCF=1.118×10-5×r×V2單位為×g（重力加速度），其中V為轉(zhuǎn)速，單位r/min；r為離心半徑，單位cm。37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期（5×106/瓶）的細(xì)胞常規(guī)消化，使用移液槍接種至培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)皿），并采用完全隨機(jī)化分組方法分為對照組、20G高重力組（以下簡稱“高重力組”）、10 μg/L ICA和20G高重力聯(lián)合組（以下簡稱“聯(lián)合組”）。三組同時接種至培養(yǎng)瓶（25 cm2），密度1×106/瓶，培養(yǎng)24 h后開始在相應(yīng)高重力下加載。實(shí)驗(yàn)組于加載機(jī)內(nèi)在相應(yīng)高重力下加載30 min連續(xù)加載3 d，對照組同步置于除G值外相同的環(huán)境中。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取加載結(jié)束后培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，每瓶加入2 mL MTT液，37℃避光孵育4 h，棄去液體，各瓶加入2 mL二甲基亞砜振蕩10 min，分別吸取200 μL至96孔板，用酶標(biāo)儀測其490 nm波長下的吸光度值。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞凋亡 取加載結(jié)束后培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化2000 r/min離心（r = 10 cm）5 min，用1/15 mol/L PBS洗滌2次，2000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)至5×105，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL Propidiumlodide混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長Ex=488 nm、發(fā)射波長Em=530 nm下進(jìn)行檢測。

1.4.3 qPCR檢測基因表達(dá) 用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)Bax、Bcl2、P53、GAPDH引物（表1）。按說明書提取各組細(xì)胞RNA。反應(yīng)條件如下：先95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)；72℃冷卻2 min。應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算各基因相對表達(dá)量。

表1 相關(guān)基因引物序列

1.4.4 透射電鏡（TEM）檢測細(xì)胞凋亡 取加載結(jié)束后培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，1/15 mol/L PBS洗滌，1500 r/min離心5 min，4%戊二醛固定2～4 h以上，4℃條件下送河北醫(yī)科大學(xué)電鏡室。按透射電鏡制片步驟制片，完成后于透射電鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測結(jié)果

高重力組吸光度顯著低于對照組（P < 0.01），聯(lián)合組細(xì)胞高重力加載后吸光度顯著高于對照組和高重力組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

高重力組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（P < 0.01），聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組和高重力組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果

與對照組比較，高重力組Bax mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.01），聯(lián)合組表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05），且聯(lián)合組表達(dá)顯著低于高重力組（P < 0.01）。與對照組比較，高重力組Bcl2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），聯(lián)合組表達(dá)明顯下調(diào)（P < 0.05），且聯(lián)合組表達(dá)顯著低于高重力組（P < 0.01）。與對照組比較，高重力組Bax/Bcl2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），聯(lián)合組略下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但聯(lián)合組顯著低于高重力組（P < 0.01）。與對照組比較，高重力組P53 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.01），聯(lián)合組表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.01），且聯(lián)合組表達(dá)顯著低于高重力組（P < 0.01）。見圖3。

2.4 透射電鏡檢測結(jié)果

TEM下觀察發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)基本正常，與對照組比較，未見明顯差異（圖4A）。高重力組細(xì)胞可見部分細(xì)胞皺縮、體積縮小、細(xì)胞膜表面微絨毛減少甚至消失，部分細(xì)胞膜呈球形向胞外膨出；細(xì)胞核核固縮，體積減小，電子密度增加，微絨毛、核仁、核孔減少，部分核膜成銳角向外突起，染色質(zhì)濃縮致密、邊集于核膜下；細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，呈中晚期凋亡現(xiàn)象（圖4B）；并可見部分細(xì)胞膜表面突起減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體水腫脊膜消失，高爾基體溶解消失，細(xì)胞核腫脹，核周系擴(kuò)張，細(xì)胞器數(shù)目減少，呈變性壞死現(xiàn)象（圖4C）。

3 討論

成骨細(xì)胞是參與骨形成、修復(fù)與重建的最重要的功能細(xì)胞之一。在骨形成的過程中多種細(xì)胞因子、激素和物理因素都可以影響成骨細(xì)胞并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能。成骨細(xì)胞增殖率的改變可直觀地反映成骨細(xì)胞的數(shù)量變化和骨組織生長重建的狀態(tài)，只有細(xì)胞數(shù)量的不斷增加才可產(chǎn)生大量的膠原，從而通過鈣化基質(zhì)的形成產(chǎn)生更多骨組織[6-7]。細(xì)胞凋亡是由基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞自主的有序的死亡方式，通過凋亡可有效清除損傷的和衰老無用的細(xì)胞，維持細(xì)胞死亡和增殖的動態(tài)平衡[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞凋亡速度對維持骨組織吸收和修復(fù)重建的動態(tài)平衡有著重要作用[10]。近年來，有國外學(xué)者研究證實(shí)，高重力刺激對成骨細(xì)胞的增殖、分化有著重要的調(diào)控作用[11-12]。ICA在骨形成和發(fā)育的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著著重要的作用[13-14]。本研究將ICA聯(lián)合高重力來探索對骨重建的調(diào)節(jié)。

MTT法和FCM檢測結(jié)果表明，20G可抑制成骨細(xì)胞增殖誘導(dǎo)并激活細(xì)胞凋亡，聯(lián)合組則可明顯提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。既往研究證實(shí)，高重力在40～80G時可抑制成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡，而本研究發(fā)現(xiàn)高重力20G時就已明顯表現(xiàn)出對成骨細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)[15]。聯(lián)合組成骨細(xì)胞增殖活性增高，凋亡率明顯下降，與殷曉雪等[16]以人成骨細(xì)胞為研究對象探討ICA對成骨細(xì)胞活性及增殖和分化的影響的發(fā)現(xiàn)相仿，其結(jié)果可能是ICA對成骨細(xì)胞活性的促進(jìn)作用所導(dǎo)致。

目前認(rèn)為Bcl-2基因家族和P53基因在凋亡的調(diào)控中有著至關(guān)重要的作用[17]。Bax基因是Bcl-2基因家族的重要成員之一，表達(dá)物Bax蛋白存在于胞質(zhì)中，是促進(jìn)凋亡所必須的，在接受凋亡信息后被激活，通過末端疏水結(jié)構(gòu)域附著于線粒體膜上，使其通透性增強(qiáng)，使細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡蛋白酶激活因子1釋放，激活caspase系統(tǒng)，進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡[18]；Bcl-2與各細(xì)胞器的膜相結(jié)合主要分布于線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可阻止多種因素引起的細(xì)胞凋亡，如生長因子缺失、應(yīng)激和化學(xué)藥物治療等[19]。Bax/Bcl2比值決定細(xì)胞凋亡的啟動，還可反映細(xì)胞凋亡的程度，是細(xì)胞凋亡極為關(guān)鍵的調(diào)控因素[20-21]。P53基因是大家公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)的抑癌基因。在生理情況下，細(xì)胞內(nèi)P53維持在很低的水平，但當(dāng)細(xì)胞受到多種不利因素刺激時，P53基因被激活并作為轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列下游靶基因的表達(dá)，可通過Bax基因或Bcl-2基因相關(guān)信號通道誘導(dǎo)其凋亡[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)高重力20G對Bax、Bcl-2、P53基因的表達(dá)均有明顯的促進(jìn)作用，聯(lián)合組對Bax、Bcl-2、P53基因表達(dá)都有顯著的抑制作用；實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞Bax/Bcl-2的比值與對照組比較發(fā)現(xiàn)，高重力組增高有顯著性差異，但聯(lián)合組略降低并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？梢?，20G條件下成骨細(xì)胞凋亡被激活，而聯(lián)合組成骨細(xì)胞凋亡明顯被抑制。

TEM形態(tài)學(xué)檢測是目前大家所公認(rèn)的確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。TEM觀察表明，20G不僅可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡還可導(dǎo)致其變性壞死，這種凋亡與變性壞死并存的現(xiàn)象可能是由于20G已經(jīng)達(dá)到或者已超出成骨細(xì)胞所能承受的能力范圍。

綜上所述，筆者推測：成骨細(xì)胞可響應(yīng)高重力刺激信號并在形態(tài)學(xué)和增殖水平發(fā)生一系列變化；高重力（20G）不僅可抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可導(dǎo)致成骨細(xì)胞發(fā)生變性壞死，但適當(dāng)濃度（10 μg/L）的ICA可逆轉(zhuǎn)高重力加載所導(dǎo)致的這種不利影響，對成骨細(xì)胞起相應(yīng)的保護(hù)作用。該研究對了解ICA聯(lián)合高重力因素對骨重建的作用十分重要，對將ICA作為骨保護(hù)藥的開發(fā)方面有著指導(dǎo)性的作用，意義重大。

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（收稿日期：2016-11-09 本文編輯：張瑜杰）