林偉雄+樂智勇+車海燕+劉蔭貞+劉沖+王暉

[摘要]制備了15批不同產(chǎn)地的甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，對(duì)甘草苷和甘草酸進(jìn)行含量測定，計(jì)算轉(zhuǎn)移率與出膏率，并建立了HPLC指紋圖譜分析方法。通過對(duì)15批甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行測定，甘草苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率范圍分別為59.4%～87.4%和49.8%～78.9%，出膏率范圍為29.9%～38.9%，并用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）軟件進(jìn)行指紋圖譜分析，確定了10個(gè)共有峰，對(duì)15批甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑分別進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，其相似度均大于0.9。該研究中甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法規(guī)范，15批樣品質(zhì)量穩(wěn)定，指紋圖譜相似度高，其方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可為甘草配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

[關(guān)鍵詞] 甘草； 標(biāo)準(zhǔn)湯劑； HPLC； 指紋圖譜

[Abstract] Fifteen batches of Glycyrrhizeae Radix standard decoction were prepared for determination of the content of the glycyrrhizic acid and liquiritin， then the transfer rate and the extract rate were calculated and a method was established to analyze the fingerprint by HPLC. According to the measurement of 15 batches of samples，the transfer rate of the glycyrrhizic acid and liquiritin were 59.4%-87.4% and 49.8%-78.9% with extract rate of 29.9%-38.9%. Moreover，10 common chromatographic peaks were determined based on their fingerprint by using similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine （TCM）（2012A） .The similarity results of 15 batches of samples were analyzed and compared，and the results showed that the similarity was all higher than 0.9. Fifteen batches of samples，prepared by a standard method，have stable quality and the high similarity.The method displayed good precision，stability and repeatability in fingerprint analysis. Therefore，this study can provide a reference for the quality control of Glycyrrhizae Radix dispensing granules.

[Key words] Glycyrrhizae Radix； standard decoction； HPLC； fingerprint

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草G. inflata Bat.或光果甘草G. glabra L.的干燥根和根莖^[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，素有“國老”之稱，是常用中草藥^[2-3]，中醫(yī)處方離不開甘草，俗稱“十方九草”^[4-5]。具有清熱解毒，補(bǔ)脾益氣，潤肺祛痰，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用^[6-7]?，F(xiàn)代研究表明，甘草的主要活性成分為黃酮類和皂苷類，甘草苷具有保肝及抗抑郁樣作用，甘草酸具有抗炎、保肝、抗病毒及類固醇樣作用，且在治療腎病、心臟疾病及抗癌等方面有著廣泛的應(yīng)用^[8]。

隨著科技的發(fā)展與進(jìn)步，配方顆粒、精制飲片、超微飲片、破壁飲片等多種中藥飲片用藥形式不斷出現(xiàn)，具有積極的臨床意義，但也存在標(biāo)準(zhǔn)不明確、劑量不統(tǒng)一、臨床合理性有待進(jìn)一步論證等各種問題^[9]。為加強(qiáng)對(duì)中藥配方顆粒的管理，國家食品藥品監(jiān)督管理總局起草了《中藥配方顆粒管理辦法》，要求應(yīng)體現(xiàn)配方顆粒多成分和整體性質(zhì)量控制，2016年8月5日，國家藥典委員會(huì)進(jìn)一步公布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，提出標(biāo)準(zhǔn)湯劑概念，明確要求中藥配方顆粒的所有藥學(xué)研究均須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對(duì)比，以保證與標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量一致性。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑可作為一種化學(xué)基準(zhǔn)，同時(shí)還可以作為效應(yīng)基準(zhǔn)的陽性對(duì)照藥，用于評(píng)價(jià)不同飲片的用藥形式，用于標(biāo)化臨床用藥，其制備遵循傳統(tǒng)湯劑的煎煮原則，整個(gè)流程具有標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的特點(diǎn)，能夠保證工藝的統(tǒng)一，進(jìn)一步保障其質(zhì)量的穩(wěn)定和統(tǒng)一，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性^[9]。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑失去了原有飲片的形態(tài)學(xué)特征，單純的指標(biāo)成分的定性和定量分析難以反映其質(zhì)量的優(yōu)劣，因而中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制要重視以指紋圖譜為主的整體質(zhì)量控制^[9]。本實(shí)驗(yàn)選用不同產(chǎn)地的15批甘草制備甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，考察了有效成分含量，轉(zhuǎn)移率和出膏率范圍，并主要建立其HPLC指紋圖譜，為甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的應(yīng)用和其他中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究提供參考數(shù)據(jù)，同時(shí)提高甘草配方顆粒的質(zhì)量控制水平。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配備G1311C四元泵，G1316A恒溫箱，G1315DDAD檢測器，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，Chem Station色譜工作站；XP6型電子分析天平（METTLER TOLEDO，精密度0.001 mg），XPE205型電子分析天平（METTLER TOLEDO，精密度0.000 1 g），KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），Arium 611DI型超純水儀（德國Sartorius公司）。

乙腈（色譜純，155803，賽默飛世爾科技）；超純水（自制）；磷酸（分析純，20080304，廣東光華化學(xué)廠）；乙醇（分析純，20160708，天津福晨化學(xué)試劑）。

甘草苷（批號(hào)111610-201607）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201418）對(duì)照品和甘草（批號(hào)120904-201117）對(duì)照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院；15批甘草藥材來源見表1，甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑由康美（北京）藥物研究院有限公司自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

2.1.1 甘草前處理 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則0213炮制通則，按《中國藥典》2015年版一部甘草項(xiàng)下炮制方法進(jìn)行炮制，除去雜質(zhì)、洗凈、潤透、切厚片、干燥制得。炮制加工得到的飲片按《中國藥典》2015年版第一部甘草飲片項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢測，均符合規(guī)定。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備^[10] 稱取甘草飲片100 g，加水煎煮2次。第1次加入水900 mL，浸泡30 min，煮沸后再煎煮1 h，用350目篩網(wǎng)趁熱濾過，濾液迅速放入冷水中攪拌冷卻；藥渣再加入水700 mL，煮沸后再煎煮30 min，用350目篩網(wǎng)趁熱濾過，濾液迅速放入冷水中攪拌冷卻；合并2次濾液，減壓濃縮（50 ℃，-0.09 MPa）至100～200 mL的流浸膏，放入冰柜冷凍（-10 ℃）過夜，用冷凍干燥機(jī)干燥，即得標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑是甘草飲片經(jīng)水煎煮提取加工制得的粉末，主要成分為甘草藥材中水溶性物質(zhì)，參照《中國藥典》2015年版第一部甘草項(xiàng)下的含量測定方法，考察了供試品制備方法，并對(duì)其方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，建立了甘草苷和甘草酸2個(gè)成分的含量測定方法，并計(jì)算其出膏率和轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率在29.9%～38.9%，平均出膏率為33.0%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%；甘草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.25%～8.25%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.90%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%，轉(zhuǎn)移率在59.4%～87.4%，平均轉(zhuǎn)移率為76.7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.0%；甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5.97%～14.80%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.79%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%，轉(zhuǎn)移率在49.8%～78.9%，平均轉(zhuǎn)移率為66.2%。標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.9%。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

Waters symmetry C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～45 min，19%～50%A）；檢測波長237 nm；流速1 mL·min^-1；柱溫25 ℃。精密吸取參照物和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄空白溶液、參照物和供試品的色譜圖，結(jié)果見圖1～3。

2.3 溶液的配制

2.3.1 供試品溶液的配制 取本品粉末約0.1 g，置具塞錐形瓶中，加入100 mL的70%乙醇，密塞，稱重，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每 l mL含甘草苷20 μg、甘草酸銨0.2 mg的溶液，即得。

2.4 HPLC-DAD指紋圖譜分析

2.4.1 精密度考察 按2.3.1項(xiàng)下方法制備同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以甘草酸色譜峰為參照，對(duì)各主要共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A）計(jì)算相似度。結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.50%，相對(duì)峰面積RSD<1.0%，相似度為1，說明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 按2.3.1項(xiàng)下方法制備同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，分別在0， 2， 4， 8， 12， 24 h時(shí)測定，記錄色譜圖，以甘草酸色譜峰為參照，對(duì)各主要共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A）計(jì)算相似度。結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.7%，相對(duì)峰面積RSD<3.0%，相似度>0.99，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜要求。

2.4.3 重復(fù)性考察 取平行制備的同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末樣品6份，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，以甘草酸色譜峰為參照，對(duì)各主要共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A）計(jì)算相似度。結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.50%，相對(duì)峰面積的RSD<2.0%，相似度為1，說明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.4.4 樣品檢測與分析 分別取15批甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末，按2.3.1項(xiàng)下方法制備得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，再按2.2項(xiàng)下色譜條件分別測定，記錄HPLC圖。將15批供試品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A）中，采用自動(dòng)匹配法生成共有模式對(duì)照?qǐng)D譜，并分析各樣品之間共有峰和相似度，確定共有峰，結(jié)果確定了15批樣品共有10個(gè)共有峰，見圖4，5，各指紋圖譜與共有模式對(duì)照指紋圖譜相似度均在0.9以上，符合指紋圖譜相似度要求。具體結(jié)果如下，S1 0.961；S2 0.953；S3 0.963；S4 0.927；S5 0.952；S6 0.975；S7 0.984；S8 0.990；S9 0.988；S10 0.987；S11 0.981；S12 0.988；S13 0.981；S14 0.995；S15 0.988。以選定的峰面積相對(duì)較大、出峰時(shí)間較穩(wěn)定的10號(hào)峰甘草酸作為參比峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果其相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.20%，相對(duì)峰面積差異較大，RSD介于20%～48%。

2.4.5 對(duì)照藥材與標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的相關(guān)性 為了驗(yàn)證制備工藝的科學(xué)性和穩(wěn)定性，用甘草對(duì)照藥材制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證其相關(guān)性。結(jié)果表明，對(duì)照藥材和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜相似度很好，有較多相同的成分。結(jié)果見圖6。

3 討論

3.1 甘草藥材來源

為保證標(biāo)準(zhǔn)湯劑的代表性，本實(shí)驗(yàn)甘草藥材的來源盡可能地包括了道地產(chǎn)區(qū)、主產(chǎn)區(qū)、傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的規(guī)范化種植藥材和野生藥材，主要采自新疆人工種植甘草藥材、山西和甘肅野生甘草藥材。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝合理性

本實(shí)驗(yàn)甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參照國家藥典委員會(huì)公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》，利用現(xiàn)代提取設(shè)備，用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的甘草飲片，以水為提取溶劑，采用物理方法分離固液、低溫減壓濃縮、冷凍干燥，制得樣品。實(shí)驗(yàn)中考慮到固液分離對(duì)成分得率的影響較大，采用趁熱過濾方式進(jìn)行固液分離，二煎過后的藥渣進(jìn)行了適當(dāng)壓榨處理，減少了成分的損失，趁熱過濾后，濾液放置冷水中迅速冷卻，抑制了各成分的熱分解，同時(shí)采用低溫減壓濃縮、冷凍干燥方法提高煎煮液中各成分的穩(wěn)定性，保證了其質(zhì)量的穩(wěn)定，最大限度上達(dá)到與傳統(tǒng)湯劑一致的目的。

3.3 供試品溶液制備方法考察

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑（乙醇、70%乙醇、50%乙醇），結(jié)果表明乙醇提取的供試品溶液中信號(hào)峰最少，70%乙醇和50%乙醇提取的供試品溶液中信號(hào)峰較多，共有成分提取效果相近，與甘草苷和甘草酸參照峰相應(yīng)的峰峰形和分離度均良好，最終確定采用70%乙醇提?。煌瑫r(shí)考察了提取方式（回流和超聲），結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流和超聲提取效果一致，因此采用操作簡便的超聲提取。

3.4 色譜條件的考察

標(biāo)準(zhǔn)湯劑是甘草飲片經(jīng)水煎煮提取加工制得的粉末，主要成分為甘草藥材中水溶性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)參照《中國藥典》2015年版一部甘草項(xiàng)下的含量測定方法，選用237 nm為檢測波長，以流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，45 min之后沒有明顯的特征峰，故梯度洗脫時(shí)間和記錄色譜圖的時(shí)間定為45 min，最終確定其洗脫方式（0～8 min，19%A；8～45 min，19%～50%A）；同時(shí)比較不同生產(chǎn)廠家（Waters， Merck， Kromasil）色譜柱的分離效果，根據(jù)特征峰的數(shù)量、分離度和各個(gè)特征峰的峰形，決定采用Waters symmetry C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

3.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)分析

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A）相似度分析結(jié)果顯示15批甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照指紋圖譜的相似度均高于0.9，表明各批甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較高的均一性，質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定，說明本實(shí)驗(yàn)建立的甘草飲片指紋圖譜中10個(gè)共有峰及對(duì)照指紋圖譜可反映其指紋特征，具有鑒別評(píng)價(jià)意義。其相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.20%，說明不同產(chǎn)地和不同批次的樣品有較多相同的成分，但相對(duì)峰面積差異較大，RSD介于20%～48%，說明不同產(chǎn)地和不同批次的樣品含量差異較大，可能與原料質(zhì)量有關(guān)。

3.6 應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫楦什菖浞筋w粒的研究制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)參照物，根據(jù)15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究結(jié)果顯示各批甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較高的均一性，質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定，說明其可作為配方顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)參照物。以標(biāo)準(zhǔn)湯劑的檢測數(shù)據(jù)為依據(jù)，可為甘草配方顆粒制定各項(xiàng)指標(biāo)，保證成品與標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量一致性。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]