劉宇飛　薛金濤　閆慧娟　楊麗娟　劉巍　孫祥德

摘要將核酸外切酶Ⅲ誘導的雙重信號放大技術(shù)與MoS2納米片的熒光猝滅性質(zhì)結(jié)合，構(gòu)建了一種高靈敏高選擇性的DNA檢測方法。首先設計兩條末端修飾熒光基團的探針核酸（HP1和HP2）。由于兩條探針核酸具有3′粘性末端， 使其不會被核酸外切酶Ⅲ降解，因而被吸附于MoS2納米片而猝滅其熒光。當目標DNA存在時，會促使核酸外切酶Ⅲ啟動雙重信號放大反應，并將探針核酸降解成大量的不能吸附于MoS2納米片表面的熒光碎片。在優(yōu)化條件下，目標DNA濃度在0.5～6.0 pmol/L范圍內(nèi)與熒光信號變化呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.28 pmol/L。與單重信號放大技術(shù)相比，本方法極大改善了分析靈敏度和檢出限，且具有良好的單堿基錯配區(qū)分能力。

關(guān)鍵詞DNA傳感器； MoS2納米片； 核酸外切酶Ⅲ； 雙重信號放大； 熒光猝滅

1引 言

特定序列核酸的檢測在病原感染、遺傳疾病、法醫(yī)鑒定以及現(xiàn)代生命科學發(fā)展等方面具有重要作用[1～5]。發(fā)展靈敏度高、準確性好且簡單、快速的核酸檢測方法仍然是目前生物分析研究的熱點[6，7]。目前，許多信號放大技術(shù)已廣泛應用于DNA檢測中，諸如核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ， Exo Ⅲ）誘導的信號放大[8～10]、DNA聚合酶誘導的信號放大[11～13]、雜交鏈式反應的信號放大[14～17]及滾環(huán)復制誘導的信號放大[18～22]等。其中，Exo Ⅲ能夠無序列選擇性地將雙鏈DNA的3′末端剪切成單核苷酸，因而成為一種極為常用的信號放大工具[23，24]。Exo Ⅲ這種獨特的性質(zhì)使其廣泛應用于核酸[8～10，23，24]、蛋白質(zhì)[25，26]及其它物質(zhì)[27，28]檢測中。Cai等[10]開發(fā)出了一種基于Exo Ⅲ的雙重放大技術(shù)，用于核酸檢測。與單重信號放大技術(shù)相比， 該方法極大提高了檢測靈敏度，并有較好的堿基錯配分析能力。

MoS2納米片是一種與石墨烯具有類似結(jié)構(gòu)的二維納米材料，其獨特的納米電子學性質(zhì)、光電子性質(zhì)及電子捕獲能力使其成為重要的能量轉(zhuǎn)移受體[29，30]。與石墨烯相比，MoS2納米片更易于大規(guī)模制備， 且無需處理即可直接分散于溶液中[31，32]。同時，MoS2納米片可與熒光染料修飾的單鏈核酸結(jié)合并猝滅其熒光。這一獨特性質(zhì)使其能夠用于構(gòu)建快速、高靈敏且低成本的生物傳感器[33～35]。然而，基于MoS2納米片的生物分析方法仍然較少[36]。

原發(fā)性血色病是一種常染色體隱性遺傳疾病，致使鐵調(diào)節(jié)相關(guān)激素的缺陷，造成胃腸道過度吸收鐵，隨后沉積在肝臟、胰腺、心臟、關(guān)節(jié)、皮膚和性腺，最終引起各器官功能的損害，而在人類遺傳性血色病中，HFE基因蛋白的突變是最常見的原因[37]。本研究將Exo Ⅲ誘導的雙重放大技術(shù)與MoS2納米片的熒光猝滅性質(zhì)相結(jié)合，用于人血色病（Human hemochromatosis， HFE）特異性序列的檢測中。當目標DNA存在時，會促使Exo Ⅲ啟動雙重放大反應，對兩條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光探針核酸（Hairpin probe 1 and hairpin probe 2， HP1 and HP2）降解，并產(chǎn)生大量熒光基團碎片，且這些碎片因不能吸附于MoS2納米片表面而使其熒光恢復。本方法由于引入MoS2納米片，不僅降低了檢測背景，且極大降低了熒光探針的用量，進而降低了檢測成本。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

RF5301PC 型熒光光譜儀（日本Shimadzu 公司），激發(fā)波長480 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。 PB10 酸度計（德國Sartorius公司）。SPA400原子力顯微鏡（AFM），SPI3800控制軟件（日本Seiko Instruments Industry公司）。JEM1200EX透射電子顯微鏡（TEM，日本電子公司）。

緩沖溶液由20 mmol/L Tris， 300 mmol/L NaCl和10 mmol/L MgCl2配制，并用HCl調(diào)節(jié)至pH 8.0； MoS2納米片（南京先豐納米科技公司）； Exo Ⅲ（Takara公司）； 其它試劑均為分析純； 實驗用水均為去離子水； 所有核酸均由上海生物生工有限公司合成，其序列見表1。

2.2樣品檢測

將2.0 nmol/L HP1、8.0 nmol/L HP2、待測樣品和Exo Ⅲ混合，并用緩沖液補足至200 μL，并在37℃下孵育一段時間后，加入適量MoS2納米片，并用緩沖液補足至400 μL。在激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm的條件下，測定上述溶液的熒光強度。所有實驗均重復3次。

3結(jié)果與討論

3.1實驗原理

本方法的檢測原理如圖1所示：首先設計兩條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針核酸HP1和HP2，其序列見表1，HP1和HP2的序列有互補的部分，但兩者均為自雜交的分子信標結(jié)構(gòu)，且互補部分主要存在于分子信標的莖部分，因而HP1和HP2不會相互雜交。當沒有目標DNA時，HP1和HP2各自保持其分子信標結(jié)構(gòu)，兩者3′粘性末端又防止了Exo Ⅲ的降解，因而HP1和HP2會被吸附于MoS2納米片表面，熒光信號被猝滅。當體系中存在目標DNA時，目標DNA與HP1雜交，HP1的3′末端成為雙鏈結(jié)構(gòu)，從而誘使Exo Ⅲ對HP1進行降解。在降解過程中，會產(chǎn)生熒光碎片基團和HP1中的T1序列（黑色加粗部分），且目標DNA從雜交復合體中重新釋放，并與另一個HP1分子雜交，重新開啟酶切反應。在第二步放大反應中，由上一步反應產(chǎn)生的T1與HP2雜交，并誘導Exo Ⅲ對HP2進行降解，進而產(chǎn)生另一部分熒光碎片，并使T1從雜交復合物中釋放。再與另一個HP2分子雜交，進入下一個循環(huán)反應。這樣，少量的目標DNA就能夠誘導兩個信號放大反應的發(fā)生，從而產(chǎn)生大量熒光碎片，而這些熒光碎片因不能吸附于MoS2表面而使其熒光得以恢復。通過熒光信號的變化，即可對目標DNA進行定量檢測。

3.2MoS2納米片的表征

MoS2納米片的特征結(jié)果如圖2所示。通過原子力顯微鏡成像（圖2A）可見，MoS2納米片的高度側(cè)面約1.5 nm。從透射電鏡圖（圖2B）可見，MoS2納米片能夠較穩(wěn)定地均勻分散于在溶液中。

3.3可行性實驗

可行性實驗結(jié)果如圖3所示，當體系中沒有目標DNA時（a），由于探針核酸HP1和HP2均為發(fā)夾結(jié)構(gòu)不能相互雜交，且Exo Ⅲ只能對3′末端為雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸降解，不能對3′末端為粘性的核酸降解， 因而大量的探針核酸仍保持單鏈結(jié)構(gòu)，且吸附于MoS2納米片表面，體系的熒光強度非常微弱。

當體系當中沒有Exo Ⅲ時（b），目標DNA只能與少量HP1雜交，大量探針核酸（HP1和HP2）仍會被MoS2納米片吸附，而是其熒光猝滅。只有當目標DNA和Exo Ⅲ同時存在時（c， d， e），目標DNA才會與HP1雜交成雙鏈結(jié)構(gòu)，雙重放大反應得以啟動，大量探針核酸被降解成單核苷酸碎片，熒光基團被釋放，且難以吸附于MoS2納米片表面，熒光強度明顯增強，且隨目標DNA濃度升高，熒光信號逐漸增強。說明這種熒光傳感器的設計可以實現(xiàn)目標核酸的信號放大檢測。

3.4條件優(yōu)化

為獲得最佳檢測結(jié)果，對檢測體系中MoS2納米片濃度、Exo Ⅲ用量及檢測時間進行優(yōu)化。

MoS2納米片濃度對HP1和HP2的熒光強度的影響見圖4，隨著MoS2納米片濃度增大，HP1和HP2的熒光強度逐漸降低。當MoS2納米片濃度在0～1.8 μg/mL范圍內(nèi)變化時，熒光強度呈線性下降； 當MoS2濃度繼續(xù)增大時，熒光強度繼續(xù)下降，但下降幅度減少； 當MoS2納米片的濃度超過3.6 μg/mL時，熒光強度變

化很小，因而MoS2納米片濃度選取為3.6 μg/mL。

ExoⅢ是體系中信號放大因子，因而需要對其進行考察。隨著Exo Ⅲ活力增大，熒光強度逐漸增強。當活力超過45 U時，熒光強度增強的幅度逐漸趨向平緩，當活力超過60 U時，熒光強度雖仍有增加，但增強幅度較少，為節(jié)省成本且保證檢測效果，后續(xù)實驗活力選擇為60 U。

酶反應時間是影響酶反應效果的重要參數(shù)?？疾烀阜磻獣r間對本體系的影響。隨著反應時間延長，檢測信號逐漸增強，當達到50 min時，酶反應逐漸趨于平穩(wěn)，達到80 min時，熒光強度變化微弱，說明反應已經(jīng)達到平衡。為保證酶反應充分和檢測效率，選取80 min為最佳反應時間。

3.5目標DNA的標準曲線及檢出限

在上述優(yōu)化的實驗條件下，對目標DNA進行定量檢測。從圖5可見，熒光強度隨著目標DNA濃度的增大而增強，表明熒光強度與目標DNA的濃度呈線性關(guān)系。

在0.5～6.0 pmol/L范圍內(nèi)，熒光強度與目標DNA濃度之間具有良好的線性關(guān)系，擬合回歸方程為y=84.84x+64.74（R2=0.9860），其中，y為熒光強度，x為目標DNA濃度（pmol/L），檢出限（3σ， n=11）為0.28 pmol/L。相較于其它HFE信號放大檢測方法[10，38]，本方法具有更低的檢出限。由于引入MoS2納米片，本方法中探針核酸無需修飾猝滅基團，且探針使用量更低，極大節(jié)省了檢測成本。

3.6選擇性實驗

為驗證本方法對目標DNA的特異性，選取目標DNA與錯配一個和兩個堿基的序列進行比較。由圖6可見，本方法能夠明顯區(qū)分目標DNA與堿基錯配序列。

在濃度相同的情況下，單堿基錯配的熒光強度僅為目標DNA的21.0%，而兩個堿基錯配序列的熒光信號則只有目標DNA的15.6%。說明本方法能夠很好地區(qū)分堿基錯配序列，具有良好的選擇性。

3.7實際樣品分析

考察本方法在復雜樣品中的檢測能力。在1%的空白血清樣品中，加入不同濃度的目標核酸，線性結(jié)果如圖7所示，在1%的空白血清樣品中，檢測信號依然與目標核酸呈良好的線性關(guān)系，表明本方法可以應用于稀釋后的血清樣品分析，具有較好的抗干擾能力。

4結(jié) 論

建立了一種基于Exo Ⅲ誘導的雙重信號放大與MoS2納米片熒光猝滅能力的新型核酸探針。本方法具有高靈敏、高選擇性且成本低的優(yōu)點。本方法具有通用性， 將探針的序列改變，則可以應用到其它DNA的檢測當中。

References

1Zhang H， Li F， Dever B， Li X F， Le X C. Chem. Rev.， 2013， 113（4）： 2812-2841

2Turner A P F. Chem. Soc. Rev.， 2012， 42（8）： 3184-3196

3Lubin A A， Plaxc K W. Acc. Chem. Res.， 2010， 43（4）： 496-505

4Wu L， Xiong E， Zhang X， Zhang X， Chen J. Nanotoday， 2014， 9（2）： 197-211

5Gerasimova Y V， Kolpashchikov D M. Chem. Soc. Rev.， 2013， 43（17）： 6405-6438

6Kong R M， Zhang X B， Zhang L L， Huang Y， Lu D Q， Tan W， Shen G L， Yu R Q. Anal. Chem.， 2011， 83（1）： 14-17

7Chen X， Hong C Y， Lin Y H， Chen J H， Chen G N， Yang H H. Anal. Chem.， 2012， 84（19）： 8277-8283

8Ren W， Gao Z F， Li N B， Luo H Q. Biosens. Bioelectron.， 2015， 63： 153-158

9Li L J， Tian X， Kong X J， Chu X. Anal. Sci.， 2015， 31（6）： 469-473

10Cai Z， Chen Y， Lin C， Wu Y， Yang C J， Wang Y， Chen X. Biosens. Bioelectron.， 2014， 61： 370-373

11Xu X T， Liang K Y， Zeng J Y. Biosens. Bioelectron.， 2015， 64： 671-675

12Wang T， Zhang Z， Li Y， Xie G. Sens. Actuator B， 2015， 221： 148-154

13Lou J， Wang Z， Wang X， Bao J， Tu W， Dai Z. Chem. Commun.， 2015， 51（78）： 14578-14581

14Wang X， Ge L， Yu Y， Dong S， Li F. Sens. Actuator B， 2015， 220： 942-948

15Hou T， Li W， Liu X， Li F. Anal. Chem.， 2015， 87（22）： 11368-11374

16Kahn J S， Trifonov A， Cecconello A， Guo W， Fan C， Willner I. Nano Lett.， 2015， 15（11）： 7773-7778

17Liu Y， Luo M， Yan J， Xiang X， Ji X， Zhou G， He Z. Chem. Commun.， 2013， 49（67）： 7424-7426

18Kobori T， Takahashi H. Anal. Sci.， 2014， 30（1）： 59-64

19Sheng Q， Cheng N， Bai W， Zheng J. Chem. Commun.， 2015， 51（11）： 2114-2117

20Tian Q， Wang Y， Deng R， Lin L， Liu Y， Li J. Nanoscale， 2015， 7（3）： 987-993

21ZHANG SongBai， ZHENG LiYing， HU Xia， SHEN GuangYu， LIU XueWen， SHEN GuoLi， YU RuQin. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（11）： 1688-1694

張松柏， 鄭麗英， 胡 霞， 沈廣宇， 劉學文， 沈國勵， 俞汝勤. 分析化學， 2015， 43（11）： 1688-1694

22Hou T， Liu X， Wang X， Jiang A， Liu S， Li F. Sens. Actuator B， 2014， 190： 384-388

23Luo M， Xiang X， Xiang D， Yang S， Ji X， He Z. Chem. Commun.， 2012， 48（59）： 7416-7418

24Freeman R， Liu X， Willner I. Nano Lett.， 2011， 11（10）： 4456-4461

25ZHOU Lu， CHENG Hui， WANG JinE， PEI RenJun. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（1）： 13-18

周 璐， 程 慧， 王金娥， 裴仁軍， 分析化學， 2016， 44（1）： 13-18

26Bi S， Luo B， Ye J， Wang Z. Biosens. Bioelectron.， 2014， 62： 208-213

27Ramezani M， Danesh N M， Lavaee P， Abnous K， Taghdisi S M. Sens. Actuator B， 2016， 222： 1-7

28Wen C， Huang Y， Tian J， Hu K， Pan L， Zhao S. Anal. Methods， 2015， 80（7）： 3708-3713

29Zhu C， Zeng Z， Li H， Li F， Fan C， Zhang H. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（16）： 5998-6001

30Xiong F， Wang H， Liu X， Sun J， Brongerma M， Pop E， Cui Y. Nano Lett.， 2015， 15（10）： 6777-6784

31Pumera M， Loo A H. TRACTrend Anal. Chem.， 2014， 61： 49-53

32Yang Y， Liu T， Cheng L， Song G， Liu Z， Chen M. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2015， 7（14）： 7526-7533

33Jia L， Ding L， Tian J， Bao L， Hu Y， Ju H， Yu J S. Nanoscale， 2015， 7（38）： 15953-15961

34Ge J， Ou E C， Yu R Q， Chu X. J. Mater. Chem. B， 2014， 2： 625-628

35Mao K， Wu Z， Chen Y， Zhou X， Shen A， Hu J. Talanta， 2015， 132： 658-663

36Xiang X， Shi J， Huang F， Zheng M， Deng Q. Biosens. Bioelectron.， 2015， 74： 227-232

37Sood R， Bakashi R， Hegade V S， Kelly S M. Br. J Gen. Pract.， 2013， 63（611）： 331-332

38Yang W， Tian J， Ma Y， Wang L， Zhao Y， Zhao S. Anal. Chim. Acta， 2015， 900（5）： 90-96

AbstractA highly sensitive and selective DNA biosensor is described based on the fluorescence quenching ability of MoS2 nanosheet and exonuclease Ⅲ （Exo Ⅲ） assisted dualsignal amplification. In this sensor， the fluorescence probes （HP1 and HP2） cannot be degraded by Exo Ⅲ due to the 3′termini protrusion and thus are adsorbed on the surface of MoS2 nanosheets， which will result in the quenching of MoS2 nanosheets toward the probes and induce a low fluorescent signal. The presence of the target DNA leads to the desorption of probes on the surface of MoS2 nanosheets due to the hybridization toward probes， generating many fluorescent fragments by Exo Ⅲ digestion and inducing dualsignal amplification. This method can improve the sensitivity and detection limit compared with single amplification method， and shows excellent selectivity in the discrimination of single base mismatched targets. On the basis of the significantly high sensitivity， the developed biosensor can be potentially extended to detect various DNA targets with excellent sequence selectivity.

KeywordsDNA sensor； Molybdenum disulfide nanosheet； Exonuclease Ⅲ； Dualsignal amplification method； Quenching ability