牟慧芳+齊雯雯+劉艷玲

摘要 在自然界中植物會不斷遭受各種病原微生物的侵襲，嚴(yán)重影響植物的生長與作物的產(chǎn)量。經(jīng)過長期互作影響，植物進化出復(fù)雜的抵御病原微生物的機制。microRNAs（miRNAs）作為一類長度在21～24nt、內(nèi)源、非編碼小RNA，能通過降解靶基因的mRNA或者抑制其翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因，進而參與植物的生長發(fā)育、非生物脅迫等眾多生物過程。近年的研究顯示，miRNA在植物抵御病原微生物的過程中扮演重要角色。本文從植物抵御細(xì)菌、病毒、真菌等方面綜述了近年來miRNA參與的植物抵御病原微生物的研究進展，為揭示植物抵御生物脅迫機制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 miRNA；調(diào)控；植物；病原微生物；靶基因

中圖分類號 Q943.2 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）23-0144-04

Abstract Pathogenic microorganisms affect plant growth and cause great loss to crop yield.Plants evolved many biochemical and molecular mechanisms for resistance to pathogens.MicroRNAs（miRNAs），a small non-coding RNA with 21～24nt length，can regulate the targets expression by cleaving target mRNA or repressing translation atthe post-transcriptional levels.miRNAs involved in many biological processes，such as plant growth and development and abiotic stress responses.Over the past years，miRNAs have been validated to play crucial roles in biotic stresses.In this review，we summarized recent research progress in plant resistance to pathogens，which provided a useful resource for further understanding of miRNA functions in biotic stress.

Key words miRNA；regulation；plant；pathogenic microorganisms；target

植物在自然界的生長過程中會不斷遭受各種病害的侵襲，對植物生長、農(nóng)作物產(chǎn)量以及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)均具有重要影響。一方面可造成農(nóng)作物的嚴(yán)重減產(chǎn)，另一方面病害會對農(nóng)產(chǎn)品的貯藏和加工過程帶來巨大危害，造成農(nóng)產(chǎn)品無法食用，甚至?xí)鹗秤煤笾卸?。因此，揭示植物抵御病原微生物的機制，對植物病害的防治工作具有重要的意義[1]。

MicroRNAs（miRNAs）是廣泛存在于動植物體以及微生物體內(nèi)的一類長度為21～24nt的內(nèi)源性非編碼小RNA。miRNA通過切割靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[2]。植物miRNA在生長發(fā)育的多個層面上扮演著重要的角色，如葉及繁殖器官的形態(tài)建成與分化、激素信號傳導(dǎo)應(yīng)答途徑、營養(yǎng)代謝等[3]。此外，miRNA還在響應(yīng)冷脅迫、鹽脅迫、機械損傷等非生物脅迫中具有重要作用[3-4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在植物抵御病原微生物侵染的過程中起重要作用。本文綜述了近年來miRNA在植物病害中的研究進展，為miRNA調(diào)控的植物抵御病原微生物過程的研究提供了理論依據(jù)。

1 miRNA與細(xì)菌侵染

常見的植物細(xì)菌性病害包括水稻白葉枯病、作物青枯病、白菜軟腐病、柑桔潰瘍病等，每年都會影響農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量，造成巨大損失。近年來，許多研究顯示miRNA參與了細(xì)菌侵染的植物過程，并且miRNA對這一過程的調(diào)節(jié)與激素有關(guān)。miR393是最早被報道的參與植物病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI，PAMP-triggered immunity）的 miRNA，研究表明miR393能負(fù)向調(diào)控生長素信號，在植物抵御細(xì)菌侵染的過程中具有重要作用[5]。miR393可被細(xì)菌鞭毛蛋白N端的縮氨酸肽段（flg22）誘導(dǎo)表達(dá)，并通過靶向植物生長素受體基因TIR1（transport inhibitor response 1）、AFB2（auxin sign-aling F-box protein 2）和AFB3負(fù)向調(diào)節(jié)生長素信號。miR393在響應(yīng)細(xì)菌的過程中具有很強的特異性，AFB1是TIR1的同源基因，由于存在與miR393靶位點的錯配而不能被 miR393靶向。在突變體tir1中，AFB1受到丁香假單胞番茄致病變種（Pst DC3000）侵染的誘導(dǎo)，但在野生型擬南芥中，雖然 miR393 被Pst DC3000誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)，但AFB1的表達(dá)水平未受到影響[5]。用細(xì)菌侵染野生型植株和miR393過表達(dá)植株后發(fā)現(xiàn)，miR393過表達(dá)植株中細(xì)菌效價比野生型植株低5倍，表明過表達(dá)miR393增加了植物的抗菌性[5]。后來的深度測序結(jié)果也驗證了miR393在植物抗菌方面的作用，擬南芥葉片被無毒性的Pst DC3000（hrcC-）侵染后3 h，miR393的表達(dá)水平約為未處理組的10倍左右[6]。

此外，miR393還參與細(xì)菌防御途徑中由效應(yīng)因子引起的ETI（effector-triggered immunity）免疫反應(yīng)。效應(yīng)子是病原菌利用Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲ Secreton System，TTSS）輸送至宿主細(xì)胞的一類蛋白質(zhì)[7]。PST Ⅲ型效應(yīng)子AvrPtoB、AvrPto 和HopT1抑制宿主細(xì)胞中的RNA沉默，從而增加植物對細(xì)菌的易感性。在擬南芥中，這3個因子分別在miR393合成過程的不同階段起重要作用。AvrPtoB能抑制miRNA基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致pri-miR393的低表達(dá)；AvrPto抑制miRNA成熟體的形成以及miRNA的運輸過程，導(dǎo)致miR393的表達(dá)量下降；HopT1抑制沉默復(fù)合體中AGO1的活性，影響miRNA的功能[8]。細(xì)菌在侵染植株的過程中對植物中 miRNA的合成產(chǎn)生影響，從而影響植物體內(nèi)的RNA沉默。

miR393在根瘤農(nóng)桿菌與植物的互作中也發(fā)揮重要作用，研究顯示其根瘤的生長可能與生長素信號途徑有關(guān)。不具有致瘤能力的農(nóng)桿菌株感染煙草不會造成miR393的表達(dá)量發(fā)生改變，而可致瘤的農(nóng)桿菌株感染煙草可誘導(dǎo) miR393下調(diào)表達(dá)。研究表明，miR393能抑制生長素信號途徑，抑制生長素信號途徑會促進腫瘤的增長[9-10]。在農(nóng)桿菌侵染煙草過程中，可通過下調(diào)miR393促進生長素信號途徑抑制農(nóng)桿菌根瘤的生長。

除了miR393，擬南芥miR160和miR167靶向植物生長素響應(yīng)因子（ARF）基因家族在無毒性的Pst DC3000（hrcC-）侵染3 h后表達(dá)量上調(diào)[7]。在Candidatus Phytoplasma aurant-ifolia侵染墨西哥檸檬樹后，檢測到miR159、miR160、miR166、miR167、miR393在細(xì)菌侵染后表達(dá)水平有明顯變化，它們的靶基因（ARF和MYB）在植物激素途徑中起重要作用[11]。此外，在細(xì)菌侵染的墨西哥檸檬樹中檢測到了較高水平的IAA，也從一個側(cè)面說明了生長素信號途徑與植株對細(xì)菌的敏感性方面有重要的關(guān)系[11]。

植物miRNA響應(yīng)細(xì)菌侵染的過程，除了與植物激素調(diào)節(jié)途徑有密切聯(lián)系，還與植物的活性氧途徑有關(guān)。細(xì)菌侵染會使植物開啟活性氧途徑，增加活性氧（ROS）積累[12]。CSD是植物抵御活性氧毒害的主要超氧化物歧化酶，其中Cu/Zn超氧化物歧化酶基因（CSD1和CSD2）已經(jīng)被驗證為擬南芥miR398的靶基因[13-14]。為了研究miR398及其靶基因在植物抗菌方面的作用，分別用有毒性的Pst DC3000和無毒性的帶效應(yīng)子的Pst DC3000（avrRpt2）和Pst DC3000（avrRpm1）侵染擬南芥。miR398的表達(dá)量在Pst DC3000（avrRpt2）和 Pst DC3000（avrRpm1）侵染后都會有明顯的下調(diào)，但Pst DC3000侵染后其表達(dá)量無明顯變化。miR398的靶基因CSD1和 CSD2在細(xì)菌感染后具有不同的表達(dá)模式，在Pst DC3000（avrRpm1）侵染后，擬南芥中CSD1的表達(dá)量有明顯的上調(diào)，但CSD2的表達(dá)量無明顯的變化，說明植物的抗菌過程中存在依賴和不依賴miR398指導(dǎo)的不同的復(fù)雜機制[15]。

此外，研究也表明miRNA響應(yīng)細(xì)菌感染的過程是一個復(fù)雜的過程，涉及到多個miRNA的共同響應(yīng)，并調(diào)控多種生物學(xué)途徑。擬南芥中，細(xì)菌鞭毛蛋白縮氨酸肽段flg22可以引起多種miRNA（miR156、miR160、miR167、miR169、miR391、miR396、miR398）及其靶基因的表達(dá)量變化，miRNA通過調(diào)控靶基因參與生長素信號途徑、活性氧途徑和DNA甲基化等多種生物學(xué)途徑進行flg22的響應(yīng)調(diào)控。此外，過表達(dá) miR398和miR773的轉(zhuǎn)基因植株對細(xì)菌感染更加敏感，細(xì)菌侵染后單位葉面積菌落數(shù)比野生型有明顯的增加[16]。

近年有研究表明，miRNA*在響應(yīng)細(xì)菌感染方面同樣起重要作用。擬南芥中miRNA393*在抵御細(xì)菌感染的過程中發(fā)揮重要作用。在無毒性株系Pst DC3000（avrRpt2）和有毒性株系Pst DC3000（EV）侵染擬南芥后，ago2在6 h和14 h都有明顯的上調(diào)，并且在接種細(xì)菌后，在ago2單突變和ago2/ago7雙突變植株中，葉片單位面積菌落數(shù)都有明顯的增加，而免疫共沉淀試驗表明，miRNA393b*和ago2蛋白緊密結(jié)合。此外，在接種細(xì)菌后，過表達(dá)miRNA393b*的植株單位葉片面積菌落數(shù)比野生型有明顯減少[17]。在Candidatus Phyto-plasma aurantifolia侵染墨西哥檸檬樹后，檢測到有許多miRNA*（miR160d*、miR157d*、miR156f*、miR169c*、miR15-7a*）表達(dá)量有明顯變化[11]。

2 miRNA與真菌侵染

植物真菌性病害是危害植物的第一大類病害，占植物病害總數(shù)的80%，常見的四大病害（霜霉病、白粉病、銹病和黑粉?。┒际怯烧婢鸬腫18]。目前，有越來越多的證據(jù)顯示miRNA在植物抗真菌過程中具有重要作用，并通過多種生物學(xué)途徑共同發(fā)揮作用。

小麥白粉病是世界性病害，已成為影響小麥生產(chǎn)的主要病害之一[19]。Xin等[20]在2010年研究了小麥?zhǔn)艿桨追鄄【腥竞髆iRNA的響應(yīng)情況，這也是首次對小麥中miRNA在生物脅迫中的作用進行的研究。分別用白粉病菌侵染小麥敏感株系Jingdong8（JD8）和相近基因型的抗性株系Jingdong8-Pm30（JD8-Pm30），檢測了這2個株系中miRNA在侵染前后表達(dá)量的變化。其中，有8個miRNA（miR393、miR444、miR827、miR2001、miR2005、miR2006、miR2011、miR2013）的表達(dá)量只在JD8株系中發(fā)生變化，有3個miRNA（miR171、miR2008、miR2012）的表達(dá)量只在JD8-Pm30株系中發(fā)生變化，有10個miRNA的表達(dá)量在JD8和JD8-Pm30株系中都發(fā)生變化，其中4個miRNA（miR156、miR159、miR164、miR396）在2個株系中都表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。與植物激素信號途徑密切相關(guān)的miR393在受白粉菌侵染的JD8-pm30植株中下調(diào)表達(dá)，表明由miRNA參與的植物激素調(diào)控在小麥抗白粉病中也起到重要作用[20]。

此外，灰霉菌（Botrytis cinerea）也是一種寄主范圍廣范的常見真菌，不僅能夠危害田間作物，并且是引起窖藏性病害的主要真菌，嚴(yán)重危害窖藏的蔬菜水果[21]。Jin等利用miRNA芯片技術(shù)研究了番茄被灰霉菌（Botrytis cinerea）侵染后的miRNA表達(dá)量變化情況，結(jié)果顯示sly-miR169的表達(dá)量在侵染后的5個時間點均上調(diào)，而sly-miR160和sly-miR171a的表達(dá)量只在處理1 d時下調(diào)。sly-miR169、sly-miR160和sly-miR171a的靶基因分別是轉(zhuǎn)錄因子NF-YA5、ARF17和SCL6。定量結(jié)果顯示ARF17和SCL6在處理12 h表達(dá)量有明顯上調(diào)，但在處理7 d時下調(diào)到未處理的水平，而NF-YA5在侵染后表達(dá)量明顯下調(diào)[22]。

在木本植物毛果楊中，miRNA能夠介導(dǎo)植株應(yīng)答楊樹潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）的侵染。運用基因芯片技術(shù)鑒定到在毛果楊被葡萄座腔菌感染后，有12個miRNA 家族的41個成員的表達(dá)量發(fā)生了變化。這些miRNA的靶基因有植物抗病蛋白（NBS-LRR proteins）、過氧化物酶、細(xì)胞分裂素氧化酶、MYB、ARF等，涉及多種生物學(xué)過程。分析了其中的CKX、CSD、POD等靶基因的表達(dá)量變化情況，顯示其在真菌處理后均有不同程度的下調(diào)表達(dá)[23]。近期研究表明，在禾本科植物玉米中zma-miR393能響應(yīng)紋枯病菌（R.Solani）感染，并通過下調(diào)其靶基因TIR1的表達(dá)量調(diào)節(jié)生長素信號途徑，進而應(yīng)答真菌感染[24]。小麥中tae-miR164在小麥條銹病侵染后表達(dá)量發(fā)生變化，其靶基因 TaNAC21/22轉(zhuǎn)錄因子在植株對條銹病的抵抗中起負(fù)調(diào)控作用[25]。

miRNA在植株系統(tǒng)防御中有重要的作用。梭型櫟柱銹菌（Cronartium quercuum f.sp.Fusiforme）侵染火炬松會導(dǎo)致部分miRNA表達(dá)量發(fā)生變化。在火炬松發(fā)育中的木質(zhì)部中，克隆得到4個保守miRNA家族和7個火炬松特有的miRNA家族中共26個miRNA?；鹁嫠筛腥緳抵P菌后會在松樹莖部表現(xiàn)梭形癭瘤，檢測這11個miRNA家族中有10個家族中的miRNA在感染部位的莖中下調(diào)表達(dá)，而在根和感染部位上部的莖中無明顯變化。雖感染部位上部的莖中 miRNA水平無明顯變化，但這些miRNA的靶基因表達(dá)量有明顯上升。表明在銹病菌感染后，火炬松可能會在未感染部分產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引發(fā)植物的系統(tǒng)防御，在病菌侵染前啟動保護機制[26]。

3 miRNA與病毒侵染

植物一般通過小RNA介導(dǎo)的RNA沉默來抵御病毒入侵，而病毒也進化出沉默抑制子對抗寄主的RNA沉默[27]。目前已經(jīng)鑒定到多種病毒沉默抑制子，最早被鑒定到的是煙草蝕紋病毒（TEV）的HcPro蛋白和黃瓜花葉病毒（CMV）的2b蛋白[28]。這些沉默抑制子通過作用于RNA沉默的不同階段，從而干擾寄主的RNA沉默過程，影響寄主與RNA沉默相關(guān)的生物學(xué)途徑[29-30]。

研究表明，多種植物miRNA在響應(yīng)病毒感染的過程中受到病毒沉默抑制子的調(diào)控。miR168在煙草、擬南芥、苜蓿以及番茄中可響應(yīng)多種病毒侵染，如番茄叢矮病毒（CymRSV）、長葉車前花葉病毒（RMV）、煙草蝕紋病毒（TEV）、菽麻花葉病毒（SHMV）等[31]。miR168靶向RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核心蛋白AGO1基因，病毒沉默抑制子p19能誘導(dǎo)miR168上調(diào)表達(dá)，下調(diào)AGO1的mRNA，保持AGO1的蛋白水平[32]。黃瓜花葉病毒（CMV）侵染擬南芥后，擬南芥中miR162、miR164、miR165、miR167、miR168明顯上調(diào)表達(dá)，同時AGO1的表達(dá)量也有明顯的上調(diào)[33]。miR162和miR168的靶基因分別是編碼miRNA合成的關(guān)鍵蛋白的DCL1基因和編碼miRNA行使功能的核心蛋白AGO1基因，它們通過自身反饋調(diào)節(jié)對自身及整個miRNA系統(tǒng)進行表達(dá)及功能調(diào)控[31，34]。黃瓜花葉病毒的2b蛋白能促進miR162和miR168的表達(dá)，通過與DCL1和AGO1的復(fù)雜互作，最終抑制 miR162對DCL1的切割及miR168對AGO1的切割，使得AGO1上調(diào)表達(dá)，同時間接調(diào)控其他miRNA的功能，具有十分復(fù)雜的調(diào)控機制[33]。最近研究顯示，黃瓜miR159和 miR858可響應(yīng)黃瓜綠斑花葉病毒（Cuucmber green mottle mosaic，CGMMV）侵染，同時這種響應(yīng)存在組織時空特異性，且變化顯著[35]。利用 RNA-seq技術(shù)對水稻黑條埃索病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）侵染后的玉米進行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出17個玉米miRNA家族中31個響應(yīng)RBSDV的miRNA成員，并且表達(dá)量差異均在2倍以上[36]。其中 miR319、miR396、miR408、miR1432、miR4366、miR8155、miR9773和miR9774家族均上調(diào)表達(dá)；miR156、miR158、miR160、miR395和 miR8677家族下調(diào)表達(dá)；而miR166、miR167、miR169和miR399家族的不同成員呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式[37]。

植物miRNA響應(yīng)病毒的過程中，除了受到病毒抑制子的調(diào)控，其響應(yīng)過程還與抗病蛋白NBS-LRR有很大的關(guān)系。蕪菁中bra-miR158和bra-miR1885在蕪菁花葉病毒（TuMV）感染后上調(diào)表達(dá)，其對TuMV的感應(yīng)具有特異性。在黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒以及真菌病原體核盤菌感染后，這2個miRNA的表達(dá)量均無明顯變化。預(yù)測bra-miR1885的靶基因是抗病蛋白NBS-LRR家族中的一員[38]。此外，煙草中的nta-miR6019 和 nta-miR6020響應(yīng)煙草花葉病毒感染。在煙草中過表達(dá)nta-miR6019 和 nta-miR6020，其靶基因NBS-LRR的表達(dá)受到抑制，并且過表達(dá)植株耐煙草花葉病毒的能力下降[39]。高通量測序結(jié)果顯示，大豆在大豆花葉病毒侵染后，有10個miRNA響應(yīng)病毒感染。其中miR160、miR393的靶基因包括ARF、AFB等參與植物激素信號途徑，miR1510的靶基因glyma12g07680編碼植物抗病蛋白NBS-LRR的同源蛋白[36]。番茄中miR482在蕪菁皺縮病毒TCV（Turnip crinkle virus）、黃瓜花葉病毒CMV（Cucu-mber mosaic virus）、煙草脆裂病毒TRV（Tobacco rattlevirus）侵染后表達(dá)量下調(diào)，其靶基因為NBS-LRR蛋白家族中的LRR1和LRR2，靶基因的表達(dá)量在侵染后表現(xiàn)出相應(yīng)的上調(diào)。在這個調(diào)節(jié)過程中，miR482具有2種調(diào)控機制，一種為傳統(tǒng)意義上的直接切割靶基因；另外一種則是切割后的靶基因形成許多次級siRNA，被稱為phasiRNA，phasiRNA能對下游的靶基因進行切割，phasiRNA的部分靶基因為NBS-LRR類基因[40-41]。

還有一些響應(yīng)病毒感染的miRNA作用機制現(xiàn)在還不明確。印度香米在被東格魯病毒（rice tungro virus）侵染后，miR-41在被感染葉片和花中都有較高積累，在被感染花中miR-41表達(dá)量大概為未感染的3倍，miR-47在感染后的葉片中表達(dá)量約為未感染葉片表達(dá)量的6倍。但miR-41和miR-47的靶基因未被預(yù)測到，因此其作用機制還需研究[42]。

植物在受2個病毒共同感染時，miRNA具有更復(fù)雜的表達(dá)模式。在馬鈴薯X病毒PVX（Potato virus X）和馬鈴薯Y病毒PVY（Potato virus Y）分別和共同感染煙草的情況下miRNA的表達(dá)模式不同。miR156在PVX和PVY共同感染的情況下，表達(dá)量高于其單獨感染。而miR171在感染第8天時，在PVX和PVY共同感染的情況下，表達(dá)量低于PVX和PVY單獨感染，且與未感染植株中表達(dá)量相似。在感染第11天，miR171在PVX和PVY共同感染的情況下，表達(dá)量低于PVX和PVY單獨感染，且表達(dá)量低于未感染植株[43]。這一現(xiàn)象在雙生病毒侵染煙草的過程中也有報道。煙草中miR4376在TYLCCNV（Y10A）和TYLCCNB（Y10β）的共侵染后表達(dá)量明顯低于在TYLCCNV（Y10A）單獨侵染后的表達(dá)量[44]。

4 結(jié)語

植物miRNA在抵御病原微生物方面具有重要作用，其參與植物免疫中的PTI和ETI過程，對病毒抑制沉默子敏感，還在植物共生固氮中具有重要作用。從現(xiàn)有研究中可看出，植物激素信號途徑在miRNA調(diào)節(jié)的植物抵御病原微生物過程中具有重要作用，在細(xì)菌、真菌、共生固氮菌、病毒與植物互作過程中都檢測到了與植物激素信號途徑相關(guān)的miRNA。此外，還檢測到一些與其他生物學(xué)途徑如氧化還原途徑相關(guān)的miRNA對病原微生物的響應(yīng)，表明 miRNA在植物抵御病原微生物過程中具有復(fù)雜的調(diào)控機制。但對于miRNA調(diào)控的病原微生物脅迫方面的研究，目前多集中于植物應(yīng)答病原微生物miRNA及靶基因的差異表達(dá)分析，而對這些差異表達(dá)miRNA及其靶基因調(diào)控機制的深入研究相對較少。miRNA在生物體內(nèi)有復(fù)雜的調(diào)控機制，逐一解析病原微生物應(yīng)答的植物miRNA調(diào)控的代謝途徑、信號途徑及生理學(xué)適應(yīng)將成為今后研究重點。透徹揭示miRNA在植物抵御病原微生物中的詳細(xì)機制，是對植物抵御生物脅迫機制的有益補充，并可能為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的生物脅迫防治提供新思路。

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