陳進斌+蘭書煥+李旭東

摘要 從畜禽養(yǎng)殖場、堆肥場、魚塘等場所分離篩選除臭功能菌，獲得6株具有顯著除臭作用的微生物，分別為酵母菌Y-1、霉菌M-1、乳酸菌L-1、芽孢桿菌B-1和B-2、光合菌P-1。采用正交試驗對功能菌進行優(yōu)化組合，研制除臭復合菌劑。結果表明：Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的最優(yōu)比例為1∶1∶1∶1∶3∶3，其對綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的平均去除率分別為54.97%、18.66%、13.12%、41.18%，對綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的最大去除率分別為72.95%、35.26%、20.20%、81.28%。復合菌劑能夠明顯減少豬糞中惡臭的產生量。

關鍵詞 豬糞；生物除臭；綜合惡臭；菌劑

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）23-0172-03

Abstract Six microorganisms with high deodorization efficiency were isolated from livestock farm，compost site and fish pond，which were identified as yeast Y-1，mould M-1，lactobacillus L-1，bacillus B-1 and B-2 and photosynthetic bacteria P-1，respectively.The six strains were made into complex microbial agent，the combination ratio was optimized by orthogonal array design.The results showed that the optimal ratio of Y-1，M-1，L-1，B-1，B-2 and P-1 was 1∶1∶1∶1∶3∶3.In the deodorization of swine manure，the average reduction rate on odor intensity，TVOC，NH3 and H2S was 54.97%，18.66%，13.12%，41.18%，respectively，and the maximum reduction rate of that was 72.95%，35.26%，20.20%，81.28%，respectively.In conclusion，addition of microbial agent can significantly reduce the odor pollutants produced by swine manure.

Key words swine manure；biological deodorization；odor intensity；microbial agent

改革開放以來，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)得到了大發(fā)展，曾創(chuàng)造了20年連增的奇跡，年均增幅逾10%。然而，畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來的環(huán)境污染對生態(tài)環(huán)境的影響也日趨嚴重[1-2]。其中，畜禽糞便產生的惡臭污染也是重要的環(huán)境污染之一。畜禽糞便中含有氨、硫化氫等有害氣體，若未能及時清除或處理，將產生甲基硫醇、二甲二硫醚、甲硫醚及多種低級脂肪酸等惡臭氣體，導致臭味成倍增加。這不僅影響了養(yǎng)殖場內畜禽的生長，而且也會對周圍居民的身體健康產生威脅[3]。因此，開展除臭研究對畜禽糞便惡臭污染控制和管理具有重要意義[4]。

當前，在畜禽養(yǎng)殖除臭中，生物除臭是研究熱點，國內外對生物除臭的研究多集中在生物濾池或生物滴濾塔除臭，如劉春敬通過構建高效生物除臭滴濾塔將臭味去除，其對H2S的去除率達90%[5]。由于這種除臭技術成本相對較高，在養(yǎng)殖場局部場所如堆肥場可采用，但對于受糞污污染的圈舍等場所因其面積大而難以大規(guī)模應用。因此，采用復合菌劑原位除臭是研究重點，目前應用最為廣泛的除臭菌劑是日本EM（有效微生物）菌劑，其利用光合菌類、乳酸菌類、酵母菌類、絲狀菌類和革蘭氏陽性菌類等菌株來抑制惡臭物質的產生或分解惡臭物質，達到除臭效果[6]。但由于EM菌的廣譜性，其在畜禽糞便除臭中的應用效果并不是十分理想。因此，研制對養(yǎng)殖場圈舍面源惡臭污染有針對性的復合菌劑尤為重要。本文則以養(yǎng)豬場圈舍面源惡臭污染治理為切入點，篩選出幾株具有顯著除臭作用的微生物，按照其功能及微生物之間的協(xié)同作用進行組合，研制高效除臭菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株。在畜禽養(yǎng)殖場、堆肥場、魚塘等場所采樣，實驗室分離篩選到酵母菌、霉菌、乳酸菌、芽孢桿菌和光合菌。

1.1.2 糞樣。試驗所用糞樣為取自四川省雙流縣富源養(yǎng)殖場的新鮮豬糞。

1.1.3 分離培養(yǎng)基。酵母菌：YPD培養(yǎng)基。霉菌：加入20～30 mg/L鏈霉素的PDA培養(yǎng)基。乳酸菌：MRS培養(yǎng)基。芽孢桿菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。光合菌：①富集培養(yǎng)基。通威光合菌分離用培養(yǎng)基10 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8；②雙層培養(yǎng)基下層。通威光合菌分離用培養(yǎng)基10 g，瓊脂10 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8；③雙層培養(yǎng)基上層。通威光合菌分離用培養(yǎng)基10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8[7]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離。①酵母菌、霉菌、芽孢桿菌的分離。稱取適量豬糞，制成菌懸液，分別加入酵母菌、霉菌、芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min下富集培養(yǎng)。將富集后的菌液采用稀釋涂布法分離，劃線純化，最后挑取單菌落至斜面保存?zhèn)溆谩＂谌樗峋姆蛛x。稱取適量豬糞，制成菌懸液，加入乳酸菌的液體分離培養(yǎng)基，30 ℃下靜置富集培養(yǎng)。將富集后的菌液稀釋涂布法分離，劃線純化，采用厭氧盒厭氧培養(yǎng)，最后挑取單菌落至斜面保存?zhèn)溆?。③光合菌的分離。取10 g魚塘的污泥加入250 mL無菌錐形瓶中，注滿培養(yǎng)基，密封瓶口，置于30 ℃、白熾燈光照下厭氧富集培養(yǎng)。待液體培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色或紅褐色時轉移至新培養(yǎng)基，2～3次重復。將富集后的菌液梯度稀釋，取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 3個稀釋度的菌液與冷卻至40～50 ℃的雙層培養(yǎng)基下層相混合注入平皿，待下層培養(yǎng)基凝固后注入上層培養(yǎng)基[7]。采用雙層平板法多次分離得到純菌落后，接種于含液體培養(yǎng)基的厭氧瓶中培養(yǎng)，保種備用。

1.2.2 菌株的篩選。將篩選出的菌株液體培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，取菌液稀釋10倍后按照10%接種量接入新鮮豬糞中，每天用感官法初步判定微生物的除臭效果，重復幾次，篩選出具有除臭作用的微生物。

1.2.3 菌株的鑒定。試劑盒提取菌株的基因組DNA（酵母菌為26S D1/D2區(qū)，真菌為18S rDNA，細菌為16S rDNA），進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳確認，PCR產物送至上海生工生物有限公司測序[8]。

1.2.4 功能菌組合比例優(yōu)化。選擇Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1 6株菌做正交試驗，采用L27（313）正交表，以Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1作為A、B、C、D、E、F 6個考察因素，選取3個添加量水平進行配制菌劑，取5 mL稀釋10倍后的混合菌劑用于除臭試驗，以5 d后裝置內的綜合惡臭濃度為指標考察效果（表1）。

1.2.5 菌劑除臭試驗。模擬圈舍面源污染，將100 g新鮮豬糞置于5 L的除臭裝置中（圖1），豬糞的厚度約為0.5 cm，加入5 mL稀釋10倍后的混合菌劑并攪拌均勻，將裝置密封，以200 mL/min的速度向裝置內通空氣使裝置內保持好氧環(huán)境，裝置后面連接2個吸收瓶。一級吸收瓶中裝有0.01 mol/L HCl溶液50 mL，用以吸收除臭裝置中產生的NH3和H2S，二級吸收瓶中裝有50 mL乙酸鋅-乙酸鈉溶液，用以吸收除臭裝置中產生的H2S。將除臭裝置置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測定裝置內的綜合惡臭、TVOC濃度和吸收瓶中的NH3和H2S含量。

1.2.6 綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的測定。綜合惡臭的測定：參照《空氣質量惡臭的測定三點比較式臭袋法》（GB/T 14675—93）[9]；TVOC的測定：SLC-OP020手提式惡臭檢測儀，韓國科學技術分析中心[10]；NH3的測定：參照《水質氨氮的測定納氏試劑分光光度法》（HJ 535—2009）[11]；H2S的測定：參照《水質硫化物的測定亞甲基藍分光光度法》（GB/T 1 6489—1996）[12]。

1.2.7 去除率的計算。計算公式具體如下：

2 結果與分析

2.1 除臭菌株的分離鑒定

從畜禽養(yǎng)殖場、堆肥場、魚塘等場所共分離篩選到6株具有顯著除臭作用的微生物，經26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，Y-1為羅倫隱球酵母菌（Cryptococcus laurentii）；經16S rDNA序列分析，B-1和B-2分別為Bacillus safensis和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），L-1為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），P-1為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）；經18S rDNA序列分析，M-1為卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。

2.2 功能菌組配比例優(yōu)化

按照表1的正交因素水平設計L27（313）正交試驗，結果如表2所示。

由表2的極差分析結果可以看出，RE>RD>RA>RC>RF>RB，6株菌對綜合惡臭去除的影響大小依次為B-2（E）>B-1（D）>Y-1（A）>L-1（C）>P-1（F）>M-1（B）。在試驗設計范圍內，優(yōu)化得到除臭菌劑的最佳配方為E3D1A1C1F3B1，與直接觀察法得到的結果相同。因此，Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的添加比例為1∶1∶1∶1∶3∶3時菌劑的除臭效果最好。

2.3 綜合惡臭的去除效果

如圖2所示，由于豬糞中的營養(yǎng)物質逐漸被消耗，對照組和試驗組的綜合惡臭濃度均隨時間的增加而逐漸降低。綜合惡臭的平均去除率為54.97%，去除率在第3天達到最大，為72.95%。

2.4 TVOC的去除效果

如圖3所示，由于TVOC的成分比較復雜，因此TVOC隨時間的變化沒有明顯規(guī)律。TVOC的平均去除率為18.66%，去除率在第3天達到最大，為35.26%。

2.5 NH3的去除效果

如圖4所示，試驗初期1～4 d，有機物質在微生物的作用下快速分解，氨氣的釋放量迅速升高，在第4天氨氣的釋放達到最高峰，然后氨氣釋放量迅速下降并趨于平穩(wěn)。試驗組的NH3釋放量低于對照組，其主要原因是加入的除臭微生物控制了銨鹽的分解，以及銨態(tài)氮被除臭微生物轉化為其他形式的氮而被固定下來。NH3的平均去除率為13.12%，去除率在第5天達到最大，為20.20%。

2.6 H2S的去除效果

如圖5所示，試驗初期有機物質在微生物的作用下快速分解，H2S的釋放量迅速升高，對照組的H2S釋放量在第4天達到最高峰，試驗組的H2S釋放量在第5天達到最高峰，隨著有機物質的消耗殆盡，H2S釋放量迅速下降。菌劑對H2S有明顯的去除效果，H2S的平均去除率為41.18%，去除率在第4天達到最大，為 81.28%。

2.7 復合菌劑除臭機理探討

相關文獻表明，復合菌劑原位除臭是一種基于微生物協(xié)同作用的多種菌群參與的除臭過程。酵母菌不僅可以分泌生理活性物質，還可以給其他有益微生物如乳酸菌等增殖所需要的基質提供重要的給養(yǎng)保障，促進有益微生物的快速生長，使其成為優(yōu)勢菌種，從而抑制產臭微生物的生長，減少惡臭氣體的釋放；而且酵母菌本身還可以產生一定量的香味，可以對糞便產生的惡臭氣體起到掩蓋作用[13]。霉菌能夠將豬糞中不易降解的淀粉分解為小分子物質，從而為其他除臭菌提供營養(yǎng)物質。乳酸菌能夠攝取光合菌、酵母菌產生的糖類形成乳酸，乳酸具有很強的殺菌能力，能夠抑制豬糞中產臭微生物的活動和有機物的急劇腐敗分解；而且乳酸菌能夠分解豬糞中在常態(tài)下不易分解的木質素和纖維素，并使有機物發(fā)酵分解。芽孢桿菌不僅具有分解作用，而且也能抑制NH3的產生。朱珊珊通過將枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵床生物除臭發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠抑制豬糞中NH3的產生[14]。光合菌能夠以豬糞中的有機物及有害氣體如H2S、NH3等為基質，合成糖類、氨基酸類、維生素類、氮素化合物和生理活性物質等，光合菌的代謝物質可以成為其他微生物繁殖的養(yǎng)分，光合菌如果增殖，其他的有益微生物也會增殖。王艷朋通過研究發(fā)現(xiàn)，沼澤紅假單胞菌在厭氧條件下能夠降解芳香烴累物質和3-氯苯酚等TVOC，而且光合菌在光照條件下能夠利用硫化氫等還原劑，經細菌型光合作用將二氧化碳還原成為有機營養(yǎng)物[15]。Sawada通過試驗也發(fā)現(xiàn)光合菌能夠將硫化物轉化為單質硫[16]。本研究研制的復合菌劑中有酵母菌、芽孢桿菌、霉菌、乳酸菌及光合菌，屬于當前生物除臭復合菌劑中的主流菌群，與EM菌中的功能菌類似，據此推測，復合菌中各種菌能發(fā)揮其功能并具有一定的協(xié)同作用，進而取得良好的除臭效果。

3 結論與討論

（1）本研究中分離到6株具有除臭作用的微生物，為酵母菌1株、霉菌1株、乳酸菌1株、芽孢桿菌2株、光合菌1株。

（2）通過正交試驗確定除臭菌劑中Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的最適比例為1∶1∶1∶1∶3∶3。

（3）將菌劑應用于糞便除臭試驗，菌劑對綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的平均去除率分別為54.97%、18.66%、13.12%、41.18%，對綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的最大去除率分別為72.95%、35.26%、20.20%、81.28%。

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