胡閃耀，陳 佳，姜佳佳，毛 翠，毛慧敏，王利通，王國水，左 波，徐在言*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學動科動醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.浙江天蓬集團有限公司，浙江 江山 324111；3.山東省榮成市俚島鎮(zhèn)俚島畜牧獸醫(yī)站，山東 榮成 264317）

大白豬FSHβ和RBP4基因多態(tài)性與繁殖性狀的相關(guān)性研究

胡閃耀1，陳 佳3，姜佳佳2，毛 翠2，毛慧敏2，王利通2，王國水2，左 波1，徐在言1*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學動科動醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.浙江天蓬集團有限公司，浙江 江山 324111；3.山東省榮成市俚島鎮(zhèn)俚島畜牧獸醫(yī)站，山東 榮成 264317）

分子標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）相對于傳統(tǒng)的育種技術(shù)，在早期選擇、選擇準確性等方面具有顯著的優(yōu)越性。該研究以633頭美系大白豬和963頭法系大白豬為研究對象，利用PCR-RFLP技術(shù)對FSHβ和RBP4基因的多態(tài)性進行檢測，并進行關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果表明：在美系和法系大白豬中均檢測到FSHβ和RBP4基因存在三種基因型（AA、AB和BB基因型）；在美系初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)大白母豬中，F(xiàn)SHβ基因BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重均顯著高于AA基因型個體（P＜0.05）；在美系和法系大白豬中，初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬RBP4基因BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重均顯著高于AA基因型個體（P＜0.05）。然而，F(xiàn)SHβ和RBP4基因研究結(jié)果與現(xiàn)有報道不盡一致，其用于大白母豬育種工作還有待進一步驗證。

豬；FSHβ；RBP4；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析

1 前言

提高產(chǎn)仔數(shù)是增加豬肉產(chǎn)量的前提基礎(chǔ)，因此，通過分子育種技術(shù)尋找與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的候選基因，對于提高母豬產(chǎn)仔數(shù)及養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要意義。通過候選基因法等途徑，F(xiàn)SHβ和RBP4等影響母豬繁殖性能的候選基因相繼被發(fā)現(xiàn)，并在不同豬種中進行了多態(tài)性研究。

促卵泡β亞基（Follicle stimulating hormone beta subunit，F(xiàn)SHβ）是促卵泡激素的兩個亞基之一，也是促卵泡激素行使生物功能的主要依賴者。在哺乳動物體內(nèi)，卵泡的形成和發(fā)育與FSHβ關(guān)系密切，F(xiàn)SHβ可以影響卵泡的數(shù)量，刺激卵泡成熟，并誘導排卵。趙要風等首次證明FSHβ基因座在大白、長白和杜洛克中與影響豬產(chǎn)仔性能的主效基因連鎖，并發(fā)現(xiàn)在該基因的第1內(nèi)含子，靠近第2外顯子處（具體位置在其DNA序列的809 bp和810 bp之間）存在一個292 bp片段的插入性突變位點[1]。此后，F(xiàn)SHβ基因及該突變位點對母豬繁殖性狀的影響就一直成為研究熱點。但是，該突變位點對母豬繁殖性能的遺傳效應，在不同群體中的研究結(jié)果卻不盡一致。在大白、長白和杜洛克豬中BB基因型個體的產(chǎn)仔數(shù)要顯著高于AA基因型個體，而在萊蕪豬、北京黑豬等部分中國地方豬種中則表現(xiàn)為AA基因型個體產(chǎn)仔數(shù)高于BB基因型個體[2-4]。另外，在FSHβ基因的Intron1內(nèi)還存在一個HaeIII酶切位點多態(tài)性，與母豬產(chǎn)仔性狀顯著相關(guān)[5-6]。這些研究結(jié)果都為FSHβ基因在豬育種中的應用提供了一定的理論依據(jù)。

視黃醇結(jié)合蛋白4（Retinol binding protein 4，RBP4）是生物體內(nèi)負責結(jié)合、轉(zhuǎn)運維生素A（VA）即全反式視黃醇及其衍生物的一種轉(zhuǎn)運蛋白。RBP4作為4種視黃醇結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)形式中的一種，參與維生素A的轉(zhuǎn)運代謝、胚胎早期發(fā)育等過程。另外，有研究發(fā)現(xiàn)RBP4在卵黃囊中有助于視黃醇在胚胎和母體間的轉(zhuǎn)運，也證明了RBP4基因?qū)ε咛サ陌l(fā)育具有重要作用。Messer等研究發(fā)現(xiàn)RBP4基因與豬繁殖性能相關(guān)，揭示該基因可能是影響豬繁殖性狀的候選基因[7]。隨后，Rothschild等在RBP4基因的第4外顯子發(fā)現(xiàn)一個MspI酶切位點存在多態(tài)性，與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，RBP4基因?qū)ωi產(chǎn)仔數(shù)具有顯著的遺傳效應[8]。近幾年的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，該突變位點在外來豬種（大白、長白、杜洛克）和中國本地豬種（民豬、萊蕪黑豬、里岔黑豬、魯萊黑豬）中均表現(xiàn)出一致的遺傳效應，即AA基因型個體的產(chǎn)仔性能要顯著高于AB和BB基因型個體[9-10]。這些報道再次證明該突變位點可以顯著影響母豬的產(chǎn)仔性能，具有提高母豬繁殖性能的應用潛力。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

美系大白豬633頭、法系大白豬963頭和6月齡法系大白豬組織樣9頭（采自浙江開盛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）?；蚪MDNA采用血液基因組DNA中量提取試劑盒（離心柱型）提取，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

2.2 基因型檢測

本研究主要利用PCR-RFLP技術(shù)進行基因分型，所用引物分別根據(jù)戴麗荷（2013）和劉璐（2012）發(fā)表的引物序列合成引物，各個所用引物的長度、退火溫度等如表1所示。

PCR擴增反應擴增體系和程序如表2所示。

酶切反應體系及條件見表3。

反應結(jié)束后，用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照保存圖片，統(tǒng)計基因型。其中，F(xiàn)SHβ基因由于是片段插入性突變，可以通過PCR產(chǎn)物直接電泳檢測，進行基因型統(tǒng)計。

2.3 分子標記的基因效應分析

本研究采用線性模型對性狀表型進行校正，并將校正后表型用于標記效應的估計。采用SAS軟件GLM模型自編程序完成。同時采用reg程序計算基因加性效應和顯性效應，并進行顯著性檢驗。所采用模型為：

Tijkl為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應（包括基因加性效應和顯性效應）；Fj、Yk、Pl、Am為固定效應，分別為家系、季度、胎次、場次效應，eijklm為殘差效應。

3 結(jié)果與分析

3.1 豬FSHβ基因的遺傳變異及其對繁殖性狀的影響

3.1.1 FSHβ基因的PCR多態(tài)性檢測

FSHβ基因第1內(nèi)含子區(qū)的突變形式是292 bp片段的插入缺失性突變，通過PCR產(chǎn)物直接電泳就可以進行基因型檢測。利用1.5%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳，檢測到產(chǎn)生三種基因型分別命名為：AA型（500 bp），AB型（500 bp+200 bp），BB型（200 bp），結(jié)果如圖1所示。

表1 基因分型引物

表2 PCR擴增體系和程序

表3 PCR-RFLP反應體系及條件

圖1 FSHβ基因PCR產(chǎn)物電泳分型結(jié)果

表4 FSHβ基因Intron1片段插入性突變在大白豬群中的多態(tài)性

表5 FSHβ基因多態(tài)性與美系大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

3.1.2 FSHβ基因在大白豬群體中的基因頻率

FSHβ基因第1內(nèi)含子292 bp的片段插入性突變在美系和法系大白豬群體中都存在多態(tài)性，基因型統(tǒng)計結(jié)果見表4。

從統(tǒng)計結(jié)果可以看出，在這兩個大白豬群體中，BB基因型頻率都遠遠高于AA基因型。等位基因B的頻率在美系大白和法系大白豬中，分別是A等位基因頻率的3.65倍和7.3倍，說明在這兩個群體中B等位基因是優(yōu)勢等位基因。

3.1.3 FSHβ基因多態(tài)性與大白豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

分別在美系和法系大白豬群體中，對FSHβ基因多態(tài)性與繁殖性狀進行關(guān)聯(lián)分析，分析統(tǒng)計結(jié)果見表5和表6。

從表5可以看出，對美系大白初產(chǎn)母豬，BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重均高于AA基因型個體，且差異顯著（P＜0.05）；對美系大白經(jīng)產(chǎn)母豬，F(xiàn)SHβ基因BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重均高于AB和AA基因型個體，其中AA基因型與BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)差異顯著（P＜0.05），初生窩重差異則不顯著。

由表6可以看出，在法系大白豬群體中，初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)及出生窩重都高于AB基因型個體，但差異不顯著。綜合來看，F(xiàn)SHβ基因的B等位基因?qū)Τ醍a(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)大白母豬的總產(chǎn)仔數(shù)及健仔數(shù)具有顯著的加性效應，而對初生窩重則沒有顯著影響。

3.2 豬RBP4基因的遺傳變異及其對繁殖性狀的影響

3.2.1 RBP4基因的PCR-MspIRFLP多態(tài)性檢測

RBP4基因PCR產(chǎn)物（550 bp）如圖2所示，用Mspl酶切后，利用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。酶切電泳檢測到3種基因型分別為：AA型有190 bp、154 bp和136 bp三條帶；BB型有190 bp、136 bp和125 bp三條帶；AB型有190 bp、154 bp、136 bp和125 bp四條帶，電泳結(jié)果見圖3。

3.2.2 RBP4基因在大白豬群體中的基因頻率

對RBP4基因在大白豬兩個品系中的基因型進行檢測，并對基因頻率分布情況進行統(tǒng)計，詳細統(tǒng)計結(jié)果如表7所示。

表6 FSHβ基因多態(tài)性與法系大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

圖2 RBP4基因PCR電泳結(jié)果

圖3 RBP4基因PCR-MspI-RFLP酶切分型結(jié)果

表7 大白豬RBP4基因MspI-RFLP基因型頻率和等位基因頻率

表8 RBP4基因MspI多態(tài)性與美系大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

表9 RBP4基因Msp I多態(tài)性與法系大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

表7統(tǒng)計結(jié)果顯示，RBP4基因MspI酶切位點在兩個品系中均存在多態(tài)性，且基因頻率分布差異較大。在美系大白豬中，B等位基因頻率顯著高于A等位基因，而在法系大白豬中A、B兩種等位基因的頻率則很接近。這也有可能是造成兩個品系繁殖性能產(chǎn)生差異的原因之一。

3.2.3 RBP4基因多態(tài)性與大白豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

對RBP4基因MspI酶切位點多態(tài)性與大白豬總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)、初生窩重等指標進行關(guān)聯(lián)分析，美系和法系大白豬的分析結(jié)果分別見表8和表9。

從表8的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可知，RBP4基因多態(tài)性與美系大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)及健仔數(shù)存在顯著的關(guān)聯(lián)性。在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬中，BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)均高于AB和AA基因型個體，且AA基因型和BB基因型個體間差異顯著（P＜0.05）；同時，BB基因型個體的初生窩重也均高于AB和AA基因型個體，但只在初產(chǎn)母豬中差異顯著（P＜0.05），在經(jīng)產(chǎn)母豬中差異不顯著。

從表9中可以看出，RBP4基因的B等位基因只對法系大白母豬的總產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重具有顯著的加性效應，在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬群體中，BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重都顯著（P＜0.05）高于AA基因型個體，而AA基因型個體與AB基因型個體間的差異則不顯著。結(jié)合美系大白豬的分析結(jié)果可知，RBP4基因的B等位基因在提高初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬的繁殖性能方面為有利等位基因。

4 討論

繁殖性狀對豬生產(chǎn)成本和經(jīng)濟回報具有重要影響，產(chǎn)仔數(shù)又是衡量母豬繁殖性能的重要指標之一[11]，因此，提高母豬繁殖性能對于提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要意義。分子遺傳標記的發(fā)現(xiàn)為提高母豬產(chǎn)仔數(shù)提供了新的育種手段，研究單個基因或分子標記對繁殖性狀的遺傳效應，可以更加精確地選擇產(chǎn)仔性狀[12]。經(jīng)過多年的QTL定位和關(guān)聯(lián)分析研究，在商品豬中鑒定出了FSHβ、RBP4等一些影響母豬繁殖性能的候選基因[13-15]。本研究在大白豬群體中對FSHβ和RBP4基因多態(tài)性與母豬的繁殖性能的關(guān)系進行了研究。

4.1 FSHβ基因多態(tài)性與大白母豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

本研究利用PCR技術(shù)在美系和法系大白豬中，對FSHβ基因Intron1中292 bp片段插入性突變的多態(tài)性進行檢測，且在兩個群體中均檢測到三種基因型存在?；蝾l率統(tǒng)計結(jié)果顯示B等位基因頻率在兩個品系中均達到了0.75以上，顯著高于A等位基因，這與FSHβ基因在外來豬種（大約克、長白、杜洛克）中以B等位基因占優(yōu)勢的報道是一致的[1-2]。分析可能是外來豬種長期對高產(chǎn)個體的選留導致B等位基因頻率逐漸升高。

FSHβ基因?qū)δ肛i繁殖性狀的遺傳效應分析顯示，B等位基因是提高大白母豬總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重的有利等位基因。在美系大白豬中，三種基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重均呈現(xiàn)BB基因型高于AB和AA基因型的變化趨勢，且AA和BB基因型個體間的差異達到顯著水平。說明FSHβ基因的B等位基因?qū)μ岣呙老荡蟀啄肛i的繁殖性能具有顯著的加性效應。在法系大白初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬中，BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重均高于AB基因型個體，但差異都沒有達到顯著水平。

綜合來看，本研究結(jié)果與FSHβ基因在商業(yè)豬種中的相關(guān)研究報道一致[6]。但是也有研究報道稱，在部分中國地方品種（萊蕪黑豬、北京黑豬和宗地花豬）中A等位基因是提高母豬繁殖性能的有利等位基因[3-4]。雖然，有關(guān)FSHβ基因變異對母豬繁殖性能的影響在不同豬種中的研究報道不一致，但本研究顯示，在美系大白豬中，F(xiàn)SHβ基因的BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AA基因型個體。由此推斷，B等位基因可以顯著提高美系大白母豬的產(chǎn)仔性能。由于在法系大白群體中檢測到的AA基因型個體很少，無法進行基因型與產(chǎn)仔性狀的關(guān)聯(lián)分析，今后還需要進一步擴大法系大白檢測群體，進一步分析FSHβ基因變異對法系大白母豬繁殖性能的影響。

4.2 RBP4基因多態(tài)性與大白母豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

本研究利用PCR-MspI-RFLP技術(shù)，對RBP4基因在美系和法系大白豬中的多態(tài)性進行了檢測，從基因頻率分布情況看，在美系大白豬中B等位基因為優(yōu)勢等位基因，頻率為0.84；在法系大白豬A等位基因為優(yōu)勢等位基因，頻率為0.51。推測這可能與RBP4基因在不同品系中的分布情況不同有關(guān)。

RBP4基因的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，在美系和法系大白初產(chǎn)及經(jīng)產(chǎn)母豬中，三種基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重均呈現(xiàn)BB基因型個體高于AB和AA基因型個體的變化趨勢，且AA基因型和BB基因型個體間的差異都達到了顯著水平（P＜0.05）。從本研究結(jié)果來看，在美系大白和法系大白兩個群體中，攜帶B等位基因的個體具有更高的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重，這與劉璐等人的研究結(jié)果一致[16]。但也有研究報道稱，RBP4基因的AA基因型個體比BB基因型個體具有更高的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)[9-10]?？梢?，RBP4基因?qū)δ肛i繁殖性能產(chǎn)生的遺傳效應在不同群體中并不一致。因此，還需要在美系和法系大白母豬中擴大試驗群體，增加繁殖性狀數(shù)據(jù)，進一步分析RBP4基因?qū)@兩個群體繁殖性能的影響，為RBP4基因在大白母豬標記輔助選擇中的應用提供更加準確的理論基礎(chǔ)。

[1] 趙要風，李寧，肖璐，等.豬FSHβ亞基基因結(jié)構(gòu)區(qū)逆轉(zhuǎn)座子插入突變及其與豬產(chǎn)仔數(shù)關(guān)系的研究[J].中國科學：C輯，1999，29（1）：81-86

[2] 戴麗荷，胡錦平，褚曉紅，等.FSHβ基因多態(tài)性及對不同品種豬繁殖性狀的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2013，25（3）：461-466

[3] 柳淑芳，閆艷春，杜立新.萊蕪黑豬FSHβ亞基基因的多態(tài)性分析[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報，2002，33（4）：403-408

[4] LUORENG Z，WANG L X，SUN S D.[Genetic polymorphism of FSH b subunit gene and correlation with reproductive traits in Beijing Black Pig][J].Yi chuan= Hereditas/ Zhongguo yi chuan xue hui bian ji，2007，29(12)：1497-1503.

[5] ROHRER G A，ALEXANDER L J，BEATTIE C W.Mapping the β subunit of follicle stimulating hormone (FSHB) in the porcine genome[J].Mammalian genome，1994，5(5)：315-317.

[6] MAGOTRA A，NASKAR S，DAS B，et al.A comparative study of SINE insertion together with a mutation in the first intron of follicle stimulating hormone beta gene in indigenous pigs of India[J].Molecular biology reports，2015，42(2)：465-470.

[7] MESSER L A，WANG L，YELICH J，et al.Linkage mapping of the retinol-binding protein 4 (RBP4) gene to porcine chromosome 14[J].Mammalian Genome，1996，7(5)：396.

[8] ROTHSCHILD M，JACOBSON C，VASKE D，et al.The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1996，93(1)：201-205.

[9] MARANTIDIS A，LALIOTIS G P，AVDI M.Association of RBP4 Genotype with Phenotypic Reproductive Traits of Sows[J].Genetics research international，2016.

[10] SUN Y X，ZENG Y Q，TANG H，et al.[Relationship of genetic polymorphism of PRLR and RBP4 genes with litter size traits in pig][J].Yi chuan= Hereditas/Zhongguo yi chuan xue hui bian ji，2009，31(1)：63-68.

[11] MARANTIDIS A，PAPADOPOULOS A I，MICHAILIDIS G，et al.Association of BF gene polymorphism with litter size in a commercial pig cross population[J].Animal reproduction science，2013，141(1)：75-79.

[12] SHORT T H，ROTHSCHILD M F，SOUTHWOOD O I，et al.Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines[J].Journal of Animal Science，1997，75(12)：3138-3142.

[13] HIDALGO AM，LOPES MS，HARLIZIUS B，et al.Genome-wide association study reveals regions associated with gestation length in two pig populations.Anim Genet，2016，47（2）：223-226

[14] TETZLAFF S，JONAS E，PHATSARA C，et al.Evidence for association of lymphoid enhancer-binding factor-1(LEF1) with the number of functional and inverted teats in pigs[J].Cytogenetic and genome research，2009，124(2)：139-146.

[15] MAGOTRA A，NASKAR S，DAS B，et al.A comparative study of SINE insertion together with a mutation in the first intron of follicle stimulating hormone beta gene in indigenous pigs of India[J].Molecular biology reports，2015，42(2)：465-470.

[16] 劉璐，梁永曄，吳正常，等.大白豬，長白豬和杜洛克豬RBP4基因多態(tài)性及其與繁殖性能的相關(guān)分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(10)：169-172.

2016-12-20）

本項目受到國家科技支撐計劃（項目編號：2014BAD20B01）、浙江省重大科技專項（項目編號：2014C02010）、中央高校基本科研業(yè)務費專項（項目編號：2014PY038；2662016PY012）資助

胡閃耀（1988-），男，河南平頂山人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面研究

*通訊作者：徐在言，華中農(nóng)業(yè)大學，動科動醫(yī)學院副教授，E-mail：xuzaiyan@mail.hzau.edu.cn