甘麥鄰，楊 露，蒲紅州，楊 瓊，李 智，朱 礪，張順華

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川省旺蒼縣畜牧食品局，廣元 旺蒼 628200；3.四川省南江縣農(nóng)業(yè)局，巴中 南江 635600；4.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 6111305；5.四川省瀘縣畜牧局，瀘州 瀘縣 646100）

畜禽保種理論與方法在豬保種工作中的應(yīng)用

甘麥鄰1，楊 露2，蒲紅州3，楊 瓊4，李 智5，朱 礪1，張順華1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川省旺蒼縣畜牧食品局，廣元 旺蒼 628200；3.四川省南江縣農(nóng)業(yè)局，巴中 南江 635600；4.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 6111305；5.四川省瀘縣畜牧局，瀘州 瀘縣 646100）

畜禽遺傳資源是重要的生物遺傳資源，是實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。文內(nèi)綜述了國內(nèi)外近年來保種理論與方法在豬保種工作中的應(yīng)用情況，認(rèn)為目前豬的保種應(yīng)當(dāng)是以群體遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的活體保種方法和分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)輔助保種方法相結(jié)合的保種技術(shù)體系。分析了相關(guān)理論和方法在實(shí)際應(yīng)用中存在的問題，以期為我國地方品種豬的保種提供參考。

豬；保種理論；保種方法

生物遺傳資源是國家的戰(zhàn)略資源，是關(guān)系到國計(jì)民生的基礎(chǔ)生物資源。畜禽遺傳資源是重要的生物資源，是培育新品種和新品系、保護(hù)動物多樣性、實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要材料，也是滿足人們未來各種需求的重要基因庫。豬肉作為世界第一肉類品種，在為人類提供營養(yǎng)需要和解決溫飽問題方面做出了重要貢獻(xiàn)[1]。縱觀世界畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖正朝著規(guī)?；?、工廠化的方向發(fā)展，這種方向轉(zhuǎn)變和人們對短期經(jīng)濟(jì)效益的追求導(dǎo)致了人們飼養(yǎng)畜禽品種的單一化——少數(shù)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的品種，畜禽品種多樣性遭到嚴(yán)重破壞。世界上豬主要飼養(yǎng)杜洛克、大白、長白等少數(shù)幾個(gè)品種，品種結(jié)構(gòu)較為單一，同時(shí)這些品種在選育過程中不斷突出其某一方面的生產(chǎn)性能使得品種內(nèi)部也高度同質(zhì)化，豬遺傳資源的多樣性受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。但是隨著人們對生物遺傳資源重要性的進(jìn)一步認(rèn)識，豬遺傳資源的保護(hù)正受到人們的關(guān)注。

1 保種理論

隨著人們對保種工作的不斷認(rèn)識，相關(guān)研究也不斷深入，盡管不同的學(xué)者對保種的理解和認(rèn)識存在偏差，但目前對于豬保種的理論主要有兩種：隨機(jī)保種和系統(tǒng)保種。

隨機(jī)保種理論建立在群體遺傳學(xué)基礎(chǔ)上，追求群體遺傳結(jié)構(gòu)的平衡，將品種視為一個(gè)整體，保存品種的全部基因[3]。盡管隨機(jī)保種理論最大程度上保存了品種的所有遺傳特性，但有限的群體很難實(shí)現(xiàn)哈代-溫伯格平衡，同時(shí)很難實(shí)現(xiàn)保種與選育的可持續(xù)發(fā)展。

系統(tǒng)保種理論根據(jù)系統(tǒng)科學(xué)的思想，把某一品種在一定時(shí)空內(nèi)的基因庫作為保護(hù)對象，利用現(xiàn)代生物技術(shù)在保種的同時(shí)結(jié)合選育最大限度保存品種的基因庫。系統(tǒng)保種理論在保存品種基本基因體系、特征和特性基因的同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對品種的選育，打破了隨機(jī)保種存在的束縛，可實(shí)現(xiàn)畜禽遺傳資源利用的可持續(xù)發(fā)展[4]。但由于無法保存品種所有基因，不可避免會丟失一些未知性狀基因，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和信息數(shù)據(jù)挖掘在保種工作的應(yīng)用可以有效減少系統(tǒng)保種理論存在的不利影響。目前的豬保種工作主要依據(jù)了系統(tǒng)保種的理論思想。

2 活體保種

活體保種是指通過建立以群體為保種對象的保種場、保種基地進(jìn)行保種。最大的群體是一個(gè)品種，而最小的群體是一個(gè)家系?；铙w保種由于可以在保種的同時(shí)開展選育工作，實(shí)現(xiàn)了在利用中動態(tài)的保護(hù)遺傳資源，是目前最實(shí)用的畜禽保種方法[5]。活體保種由于需要維持一定數(shù)量個(gè)體的保種群并合理規(guī)劃管理，需要較大的維持成本，同時(shí)活畜還面臨著疾病、自然災(zāi)害等風(fēng)險(xiǎn)。在活體保種工作中近交系數(shù)增量可以反映保種效果，群體大小、性別比例、留種交配制度等因素可以影響近交增量。在理想群體（群體每個(gè)世代含量保持不變，完全隨機(jī)交配，無其他系統(tǒng)影響因素存在）中近交系數(shù)增量（△F）的大小由群體有效含量（N）決定，假設(shè)初始群體無近交存在，則t世代時(shí)的近交系數(shù)（Ft）與近交系數(shù)增量之間存在如下關(guān)系：

2.1 群體大小

2.2 性別比例

2.3 留種交配制度

常用的留種方式有隨機(jī)留種和各家系等量留種兩種方式[6]，考慮到不同性別親本對后代遺傳貢獻(xiàn)存在差異，同時(shí)盡可能保持每個(gè)世代群體大小一致，因此通常采用各家系等量留種的方式在每一個(gè)世代留種時(shí)，從每一頭種公畜的后代中選留一個(gè)公畜，每一頭種母畜的后代中選留一頭雌性個(gè)體。對于選留的個(gè)體施行非同型交配系統(tǒng)，在隨機(jī)交配的基礎(chǔ)之上進(jìn)行人為干預(yù)，盡量避免全同胞、半同胞等親緣關(guān)系接近的個(gè)體進(jìn)行交配，可以有效控制群體近交系數(shù)的增加。

3 生物技術(shù)輔助保種

3.1 超低溫冷凍保種

利用冷凍保存技術(shù)可以將細(xì)胞置于-196 ℃的環(huán)境中使其暫時(shí)脫離生長狀態(tài)新陳代謝停止進(jìn)行保存，在需要時(shí)再將細(xì)胞升溫后恢復(fù)細(xì)胞活力[8]。冷凍保存技術(shù)需要遵循一定的操作程序并配套使用相關(guān)的冷凍保護(hù)劑。冷凍保存的方法目前有程序化慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。程序化慢速冷凍采用較低濃度的冷凍保護(hù)劑在程序化冷凍儀的控制下緩慢降溫使冷凍保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞，稀釋細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)使細(xì)胞內(nèi)的冰晶損傷和溶質(zhì)性損傷降到最低。玻璃化冷凍法使用高濃度的冷凍保護(hù)劑，降溫速度可超過1 500 ℃/ min，使胞質(zhì)內(nèi)外的水快速通過冷凍敏感區(qū)減少胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生，冷凍效率更高[9，10]。研究表明減少細(xì)胞中的脂質(zhì)含量可以降低細(xì)胞在冷凍保存中的損傷[11]，Momozawa等發(fā)現(xiàn)離心去脂可明顯改善卵母細(xì)胞解凍后的形態(tài)正常率、受精率和卵裂率[12]。目前大量研究表明玻璃化冷凍法優(yōu)于傳統(tǒng)的程序化慢速冷凍法，具有操作簡單、凍融效果好、存活率高等特點(diǎn)[13，14]。冷凍保護(hù)劑主要分為膜滲透性冷凍保護(hù)劑和非膜滲透性冷凍保護(hù)劑兩種。膜滲透性冷凍保護(hù)劑主要使用乙二醇、二甲基亞砜等，可在細(xì)胞表面形成一層玻璃樣狀，同時(shí)降低溶液的冰點(diǎn)，防止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成[15]。非膜滲透性冷凍保護(hù)劑主要使用蔗糖、葡萄糖、脂蛋白等，可增加溶質(zhì)的濃度產(chǎn)生跨細(xì)胞膜的濃度梯度，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)部，作為細(xì)胞外液抗凍保護(hù)劑[16]。研究表明通過二者聯(lián)用可以達(dá)到更好地抗凍保存效果[17]。目前冷凍保存在豬的保種應(yīng)用中以配子冷凍（精子和卵細(xì)胞）和胚胎冷凍技術(shù)較為成熟[18]。

3.1.1 精液的冷凍保存

早在1949年P(guān)olge等就已經(jīng)利用低溫保存的精液進(jìn)行人工授精[19]，隨后又有人分別利用顆粒狀冷凍精液和細(xì)管狀冷凍精液進(jìn)行豬的人工授精并獲得了成功[20，21]。由于不同動物精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)不同[22]，與牛、羊等動物相比豬精子的抗凍效果差[23]，精液冷凍之后存在存活率低，人工授精妊娠低等問題，同時(shí)豬是多胎動物使用冷凍精液會導(dǎo)致產(chǎn)仔數(shù)下降，因此全世界范圍內(nèi)應(yīng)用豬冷凍精液進(jìn)行人工授精的比例不到1%[24]。但是保種更關(guān)注時(shí)間的延續(xù)，冷凍精液保存技術(shù)結(jié)合人工授精技術(shù)的實(shí)施得以使配種可以不受公畜所處環(huán)境和生命體征的限制，相當(dāng)于延長了公畜的配種年齡，延續(xù)了公畜的性狀和基因[18]，因此利用豬冷凍精液保存技術(shù)對品種予以保護(hù)仍然是一種安全經(jīng)濟(jì)的豬保種措施，并在豬保種工作中得到了廣泛的推廣和應(yīng)用。

3.1.2 卵母細(xì)胞或卵巢的冷凍保存

除了對精液進(jìn)行冷凍保存，還可以通過冷凍卵細(xì)胞或卵巢來進(jìn)行保種。由于卵細(xì)胞的體積較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等原因，卵細(xì)胞的抗凍能力不如精子，因此復(fù)活率往往也比精子更低[24]。但是冷凍卵細(xì)胞技術(shù)仍在不斷的發(fā)展，有研究表明在卵母細(xì)胞成熟階段中的GV期、GVBD期和MⅡ期被認(rèn)為是最有利進(jìn)行玻璃化冷凍的階段[25-27]，但還有一些研究發(fā)現(xiàn)冷凍保存在減數(shù)分裂階段不會影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[28]。目前利用超數(shù)排卵與活體采卵等技術(shù)收集所選雌性個(gè)體的卵細(xì)胞然后進(jìn)行冷凍保存，相當(dāng)于延長了母畜的配種年齡，保存了所選母畜的性狀和基因。在合適的時(shí)候進(jìn)行升溫，迅速恢復(fù)卵細(xì)胞的活性，進(jìn)行體外受精與胚胎移植。

胚胎冷凍保存則可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)延長保種公母畜配種年齡的目的，但胚胎冷凍保存需要采取特殊的保存方法和程序來避免解凍過程中可能造成的胚胎細(xì)胞的骨架發(fā)生改變、染色體或DNA異常以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變。在冷凍保存上，卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于胚胎的冷凍保存，早在1972年就有人成功進(jìn)行了小鼠8細(xì)胞期胚胎的冷凍保存[29]，此后冷凍胚胎技術(shù)成功地應(yīng)用在了多種動物身上，但是豬胚胎由于對溫度和冷凍劑的敏感，豬胚胎冷凍保存效果一直不理想[30]，Nagashima等人將豬胚胎離心后通過顯微操作移除胚胎中的脂肪有效改善了豬胚胎冷凍保存效果不佳的問題[31]。

3.1.3 體細(xì)胞冷凍保存

體細(xì)胞冷凍保存，胚胎、幼體或成年動物的肝、腎、皮膚等組織，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)，再經(jīng)酶消化等處理后以預(yù)定的程序冷卻，然后就可以在液氮中長期保存。通過解凍復(fù)蘇后可在體外實(shí)現(xiàn)增殖、分化。早在1885年W Roux首次提出組織培養(yǎng)這一概念，1907年 R Harrison就進(jìn)行了體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察到了蛙神經(jīng)突起生長的過程，之后建立了體外培養(yǎng)活體組織的培養(yǎng)體系[32]。目前全世界范圍內(nèi)建立了多個(gè)用于統(tǒng)一保存典型培養(yǎng)物的保存中心，1986年中國科學(xué)院昆明動物研究所籌建了野生動物細(xì)胞庫，2001年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所遺傳資源研究室構(gòu)建了包含狼山雞、民豬在內(nèi)的多個(gè)地方畜禽品種的成纖維細(xì)胞庫[33]。

由于目前還沒有離體完成胚胎發(fā)育全過程的技術(shù)，不論是冷凍配子還是冷凍胚胎，最終解凍復(fù)蘇后都面臨需要活體母畜承擔(dān)受體的功能，盡管可以用親緣關(guān)系較近的品種進(jìn)行代孕但冷凍保存是否會引起配子和胚胎遺傳上的改變還不清楚，因此冷凍保種技術(shù)往往還須結(jié)合活體保種才能實(shí)現(xiàn)。

3.2 基因文庫

基因文庫可分為基因組文庫和cDNA文庫[34]，利用基因文庫進(jìn)行保種是運(yùn)用重組DNA技術(shù)將需要保種品種細(xì)胞的總DNA運(yùn)用DNA酶切之后隨機(jī)連接到合適的載體上，然后轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞中，通過宿主細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)各個(gè)片段的無性繁殖系，在需要的時(shí)候通過轉(zhuǎn)基因工程將保存的基因重新整合到受體動物基因組中，使想要表達(dá)的性狀在轉(zhuǎn)基因動物中表現(xiàn)出來[35]。

利用基因文庫進(jìn)行保種需要建立完善的基因工程技術(shù)、細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)和相關(guān)的分子遺傳學(xué)技術(shù)作支撐，難度較大[36]。Murraya 等人首次成功構(gòu)建了一個(gè)長度為55kb的酵母人工染色體[37]。1997年完成了豬的酵母人工染色體構(gòu)建[38]，在2000年李雪梅等人以pBluescriptKS+噬菌粒為載體，構(gòu)建了豬的小插入片段基因組文庫[39]?；蛭膸毂７N只有厘清了基因的作用才能有的放矢地利用基因文庫中的基因同時(shí)避免其帶來的副作用，由于基因文庫保種相關(guān)技術(shù)還不夠成熟，構(gòu)建有效的保存文庫較困難，加之基因文庫在擴(kuò)增期間有可能發(fā)生突變和重組，因此在建立基因文庫的同時(shí)仍然需要飼養(yǎng)一定數(shù)量的保種群體[40]。

3.3 分子遺傳標(biāo)記

分子遺傳標(biāo)記主要有限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）和微衛(wèi)星標(biāo)記幾種。利用與目標(biāo)基因有緊密連鎖的DNA標(biāo)記，對目標(biāo)基因在保種過程中的分離和重組進(jìn)行跟蹤，通過有意識地選留而加以保護(hù)，使之不因遺傳漂變而丟失[35]。利用廣泛存在于基因組的DNA標(biāo)記，可以分析各個(gè)世代不同個(gè)體的基因同源度，指導(dǎo)種畜的選留[41]。在提高保種準(zhǔn)確性的同時(shí)，使小群體保種成為可能。通過QTL（數(shù)量性狀位點(diǎn)）定位尋找到相關(guān)的基因簇，可以提高豬的保種、選育效率[42]。隨著相關(guān)配套綜合技術(shù)的發(fā)展，分子遺傳標(biāo)記輔助保種發(fā)展迅速，近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)豬的基因組約有1 000多個(gè)DNA 標(biāo)記被定位能較好地覆蓋豬整個(gè)基因組。Sun等繪制了豬18號染色體上的生長激素受體基因圖譜[43]，還有人利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究了大白、約克夏和漢普夏豬的遺傳差異[44]。吳豐春等人利用AFLP技術(shù)對貴州小型香豬的基因組DNA進(jìn)行了研究[45]。但是單純地利用分子遺傳標(biāo)記對保種群體進(jìn)行選留，往往不能全面考慮到豬保種群的實(shí)際生產(chǎn)性能、生活力等因素，因此分子遺傳標(biāo)記仍然要結(jié)合傳統(tǒng)的豬保種方法進(jìn)行。

3.4 其他生物技術(shù)在豬保種中的應(yīng)用

盡管豬是多胎動物，利用超數(shù)排卵和胚胎分割、移植相關(guān)技術(shù)可進(jìn)一步發(fā)揮優(yōu)秀母畜的作用，豬的超數(shù)排卵一般采用PMSG + HCG的方法處理，可以獲得比正常排卵更多的卵子[46]?？寺∨咛ヒ惨言谂?、羊、豬等動物獲得成功。1997年多利羊的誕生揭開了體細(xì)胞克隆技術(shù)的序幕，緊接著2002年誕生了第一頭體細(xì)胞克隆豬[47]。這些生物技術(shù)豐富了豬的保種研究和實(shí)踐工作，為豬保種工作的進(jìn)一步開展實(shí)施提供了思路。

4 總結(jié)

隨著時(shí)間的推移，相關(guān)的理論體系不斷完善，相關(guān)的科學(xué)技術(shù)和手段也不斷發(fā)展；不同學(xué)科間的交叉越來越普遍，聯(lián)系越來越密切。保種工作需要利用當(dāng)前社會可利用的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)和理論才能實(shí)現(xiàn)長足有效的進(jìn)展。目前豬的保種應(yīng)當(dāng)是以群體遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的活體保種方法和分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)輔助保種方法相結(jié)合的保種技術(shù)體系，只有這樣才能夠?qū)崿F(xiàn)對地方豬種的有效保護(hù)。

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2016-12-06）

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2016NZ0089；2015NZ0013），四川省科技富民強(qiáng)縣專項(xiàng)行動計(jì)劃項(xiàng)目“巴山土豬產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)與示范”和四川省教育廳科研項(xiàng)目（16ZB0038）資助

甘麥鄰(1993-)，新疆喀什人，男，碩士研究生，動物遺傳育種與繁殖專業(yè)。

E-mail：1660600546@qq.com。

張順華，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：豬的遺傳育種。E-mail：363445986@qq.com；

朱礪，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：豬的遺傳育種。E-mail：zhuli7508@163.com