曹 毅，陸 寧，陳興江，孟建玉，商勝華

(貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081)

煙草青枯病病圃土壤細(xì)菌組成的高通量測序分析

曹 毅，陸 寧，陳興江，孟建玉，商勝華

(貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081)

為了解煙草青枯病與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，采用454焦磷酸測序技術(shù)對煙草青枯病抗性鑒定圃中的土壤細(xì)菌組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，從病圃土壤中獲得了1 963條高質(zhì)量序列，歸屬于14個已知細(xì)菌門類、尚未培養(yǎng)出的細(xì)菌和分類地位未知的種類，其中變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門、芽單胞菌門為病圃土壤中的優(yōu)勢菌群，分別占總菌群數(shù)的29.91%、17.10%、13.73%、11.46%、7.08%、6.40%。煙草青枯病病圃土壤中的擬桿菌門和放線菌門細(xì)菌在總菌群中豐度較低，可能與煙草青枯病發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。

煙草； 青枯?。?土壤； 細(xì)菌群落； 高通量測序

煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種細(xì)菌性土傳病害，具有廣泛的寄主，可以侵染50多個科的200多種植物，其中煙草、馬鈴薯、番茄等茄科作物受害最為嚴(yán)重[1]。從1880年在美國北卡羅來納州首次被發(fā)現(xiàn)至今已有130余年的歷史，如今煙草青枯病幾乎分布于世界上所有烤煙種植區(qū)，其中熱帶和亞熱帶煙區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重，該病是威脅世界煙草生產(chǎn)的一大毀滅性病害[2]。目前，利用化學(xué)防治、合理輪作、抗病品種、植物抗性誘導(dǎo)、土壤改良修復(fù)及綜合防控等措施防治作物青枯病均未能有效控制病害的發(fā)生[3-6]。發(fā)展對人畜安全、環(huán)境友好的生物防治備受重視。近年來，國內(nèi)外利用無致病力青枯菌菌株[7]、根際微生物[8]、植物內(nèi)生菌[9]、噬菌體[10]防治青枯病取得了一些進(jìn)展，現(xiàn)有生物防治實踐在實驗室或溫室內(nèi)取得了一定的控病效果，但在大田生產(chǎn)上卻鮮有成功報道，土壤中土著微生物的競爭和復(fù)雜土壤理化特性等生態(tài)因子協(xié)同作用下的土壤抑菌作用，是影響生防微生物在土壤中萌發(fā)、定殖、種群構(gòu)建進(jìn)而發(fā)揮生防作用的關(guān)鍵因子[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，土傳病害的發(fā)生是由于土壤中數(shù)量巨大的微生物間的生態(tài)位競爭使得種群結(jié)構(gòu)失衡而導(dǎo)致[12]?，F(xiàn)有對土壤微生物的種類、多樣性及功能的認(rèn)識幾乎都是基于實驗室純培養(yǎng)方法進(jìn)行，然而通過培養(yǎng)方法估計的土壤微生物種類不到總量的1%[13]，對微生物群落整體構(gòu)成特征及功能的認(rèn)識更遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對其個體的認(rèn)識。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善，特別是近年來不斷發(fā)展的基于高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)，在理論上覆蓋了樣品中的全部微生物，為揭示特定復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的本質(zhì)提供了新策略。因此，利用高通量測序技術(shù)研究青枯病病土中的微生物組成和多樣性，對于認(rèn)識病害發(fā)生及實現(xiàn)生物防治具有重要意義。位于貴州省黔南州福泉市貴州省煙草科學(xué)研究院的的煙草青枯病抗病鑒定圃自1986年作為煙草品種抗病鑒定病圃使用，1997年國家煙草專賣局指定其作為全國煙草品種抗病鑒定病圃，到目前為止已進(jìn)行了3 000余份品種資源的抗性鑒定[14]，病圃年度間發(fā)病均勻且常年未使用化學(xué)藥劑和其他防治措施，是自然條件下進(jìn)行煙草青枯病病土微生物研究的優(yōu)良材料。因此，對該病圃土壤細(xì)菌種群進(jìn)行高通量測序分析，旨在為深入掌握大田病土中的細(xì)菌組成、多樣性進(jìn)而調(diào)控土壤微生物區(qū)系、控制土傳病害奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

土壤取自貴州省煙草科學(xué)研究院福泉煙草青枯病病圃。田間5點取樣，去除表土后，用滅菌鏟采取10～25 cm深的土壤樣品，充分混勻后分別用5 mm、2 mm滅菌土篩去除植物殘根、大塊土壤，過篩土壤裝入無菌封口袋，通過冰袋冷藏運送至實驗室進(jìn)行土壤總DNA制備。

土壤總DNA提取試劑盒Power Soil?DNA Isolation Kit購自MOBIO公司(MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA)，Qubit?2.0 dsDNA定量分析試劑盒購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，擴增和測序用的試劑及耗材購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。16S rDNA Amplicon 454高通量測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA提取 稱取10 g土壤，于滅菌研缽中加入液氮研磨樣品，稱取250 mg研磨后的土壤(3個平行)，參照說明書的方法，在提取前進(jìn)行65 ℃水浴處理10 min，并用樣品研磨儀(Retsch MM400)進(jìn)行20 Hz、2 min振蕩，以利于土壤內(nèi)微生物的充分破碎。其余步驟參照說明書方法進(jìn)行，提取后通過瓊脂糖凝膠電泳和Qubit 2.0定量平臺檢測提取的總DNA質(zhì)量和濃度，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高通量測序 采用細(xì)菌16S rDNA V1—V3區(qū)通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)擴增目的片段。引物融合454接頭序列(Prime A：CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG，Prime B：CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG)、Key堿基(TCAG)和標(biāo)簽序列(Barcode：CGTACGC)，本試驗所用融合引物如下：正向融合引物=Prime A+Key堿基+Barcode+27F，反向融合引物=Prime B+518R。

PCR擴增采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，包括1×PCR buffer，0.2 μmol/L正、反向融合引物，0.2 mmol/L dNTPs，10 ng基因組DNA，2.5 U PlantiumTaq，滅菌水補足50 μL。采用降落(touch down)PCR擴增目的片段：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 60 s(5個循環(huán))；94 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s(20個循環(huán))；72 ℃最后延伸8 min。PCR反應(yīng)重復(fù)3次，擴增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，參照膠回收試劑盒(MinElute? Gel Extraction Kit，Qiagen)說明書方法回收擴增產(chǎn)物，采用Qubit 2.0定量平臺進(jìn)行濃度測定，產(chǎn)物送交生工生物工程(上海)股份有限公司利用羅氏454 GS FLX Titanium平臺進(jìn)行測序。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理和分析主要采用Mothur[15]軟件進(jìn)行，根據(jù)Barcode序列區(qū)分樣品，獲取有效序列，采用PyroNoise算法[16]去除測序時的噪音、低質(zhì)量序列；去除序列末端的后引物和接頭序列、多堿基N、polyA/T尾巴、低質(zhì)量堿基及Barcode標(biāo)簽和前引物序列；丟棄測序長度短于200 bp、模糊堿基數(shù)大于0、序列平均質(zhì)量低于25的序列，統(tǒng)計優(yōu)化序列數(shù)據(jù)和長度分布。運用UCHIME[17]軟件去除嵌合體，最遠(yuǎn)鄰接法聚類生成可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。將代表性序列與Greengene分類數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行比對，賦予各OTU分類地位[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

測序后，樣本共獲得3 613條序列(圖1A)，原始測序數(shù)據(jù)長度主要集中在400～600 bp，少部分序列分布于100～300 bp。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA V1—V3區(qū)長度及454測序特點，去除了長度200 bp以下、模糊堿基數(shù)大于0、序列平均質(zhì)量低于25的序列，共獲得3 334條初步優(yōu)化序列(圖1B)。

A.原始測序序列長度及分布統(tǒng)計;B.優(yōu)化序列長度及分布統(tǒng)計

2.2 測序數(shù)據(jù)的處理

提取非重復(fù)序列(3 069條)與Greengene數(shù)據(jù)庫比對，加入gap對齊，“掐頭去尾”將所有序列長度截齊，并去除噪音序列，獲得2 079條序列；去除92條嵌合體序列(約占總序列數(shù)的4.4%)，將余下序列與Greengene注釋數(shù)據(jù)庫比對，去除匹配不上的雜序列如植物線粒體、葉綠體序列，最終獲得1 963條高質(zhì)量序列用于后續(xù)分析。

2.3 基于OTU的菌群豐富度和多樣性

就細(xì)菌16S rDNA序列而言，按相似性水平可得到不同OTU，一般認(rèn)為，相似性97%(0.03)可以定義為種水平，相似性95%(0.05)可以定義為屬水平。本研究將序列相似性在97%水平的序列合并為一個分類單元，1 963條序列共獲得1 081個OTU。從樣本中抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計個體所代表的物種數(shù)目，分別以個體數(shù)和物種數(shù)構(gòu)建稀釋性曲線。從本研究數(shù)據(jù)構(gòu)建的稀釋性曲線(圖2)來看，在測序量增加的初始階段，OTU數(shù)量呈急劇上升趨勢，隨測序量的不斷增加，OTU數(shù)量的增加基本趨向于平緩，但仍有上升趨勢，表明本次取樣基本合理，可以初步反映土壤中細(xì)菌種群構(gòu)成，但尚有部分微生物未被發(fā)現(xiàn)。

圖2 病圃土壤樣品的稀釋性曲線

2.4 基于分類地位的菌群組成分析

將OTU中每一條優(yōu)質(zhì)序列與Greengene分類數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，找出其最相近且可信度(threshold)達(dá)80%以上的種屬信息后，將每一個OTU中的所有序列進(jìn)行類比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先種屬信息，在保留最可能多信息量的情況下，確保得出信息的準(zhǔn)確性。從門水平上的分類結(jié)果來看(圖3)，病圃土壤中細(xì)菌共有14個已知細(xì)菌門：變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠菌門(Chlorobi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)；其余為尚未獲得培養(yǎng)的細(xì)菌(Candidate division TM7、TM6、WS3、OD1、FBP、BRC1)及分類地位未知的種類(unclassified bacteria)。從組成比例來看，變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門、芽單胞菌門為土壤中的優(yōu)勢菌群，分別占總菌群數(shù)的29.91%、17.10%、13.73%、11.46%、7.08%、6.40%。

圖3 門分類水平下的細(xì)菌組成

3 結(jié)論與討論

土壤環(huán)境中存在大量未知或不可培養(yǎng)的微生物，利用傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)如變性/溫度/時間溫度梯度凝膠電泳(denatured/temperature/temporal temperature gradient gel electrophoresis，DGGE/TGGE/TTGE)、末端限制性片段長度多樣性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、Southern印記、定量PCR、基因芯片等研究微生物多樣性已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物中[19]，基于細(xì)菌16S rDNA的454焦磷酸高通量測序技術(shù)由于可直接研究環(huán)境中的總DNA，通量、靈敏度高，無需克隆建庫而直接測序，避免了傳統(tǒng)研究手段的技術(shù)繁瑣、通量及靈敏度低、定量困難等局限，為研究微生物群組成和多樣性開辟了新技術(shù)平臺[20]。本研究利用454測序技術(shù)分析了典型自然條件下煙草青枯病病土細(xì)菌的組成和多樣性，通過測序數(shù)據(jù)處理和分析，獲得1 963條優(yōu)化序列，從稀釋性曲線結(jié)果來看，曲線還有上升趨勢，表明本次采取的樣品中還有未探測到的細(xì)菌。一方面，可能由于454多樣品測序時樣本所分配得到的序列數(shù)偏少；另一方面，本研究是對細(xì)菌16S rDNA的V1—V3區(qū)進(jìn)行測序，如果對16S rDNA其他可變區(qū)進(jìn)行測序可能獲得更好的結(jié)果。分類學(xué)分析表明，煙草青枯病病圃土壤中細(xì)菌由14個已知細(xì)菌門類、尚未培養(yǎng)出的細(xì)菌和分類地位未知的種類組成，其中變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門、芽單胞菌門為病圃土壤中的優(yōu)勢菌群。在現(xiàn)有農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性研究中，無論作物類型、土壤理化性質(zhì)、生態(tài)因子、地理位置等存在何種差異，擬桿菌門細(xì)菌均被認(rèn)為是農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群[21-23]，而本研究的結(jié)果表明，該門細(xì)菌僅占病圃土壤細(xì)菌的1.5%，這一菌群在病圃土壤微生物系統(tǒng)中顯著不平衡，可能與煙草青枯病發(fā)生存在密切聯(lián)系，該類群細(xì)菌與煙草青枯病的互作關(guān)系值得進(jìn)一步深入研究。此外，對青枯病及其他植物病害具有較好生防作用的放線菌門細(xì)菌[24]在病圃土壤中雖然為優(yōu)勢菌群之一，但并不占主導(dǎo)地位，這一菌群在煙田土壤中的低豐度存在可能也與病圃青枯病的嚴(yán)重發(fā)生相關(guān)。擬桿菌門和放線菌門在土壤細(xì)菌中組成比例的降低或許能作為大田煙草青枯病易發(fā)的指標(biāo)。

本研究對煙草青枯病病田土壤細(xì)菌種群的組成和多樣性有了更為全面的認(rèn)識，未來可進(jìn)一步對細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的時空變化規(guī)律、細(xì)菌種群及其他微生物(真菌、古菌、病毒等)與青枯病的相互關(guān)系等方面進(jìn)行深入研究，為有針對性地篩選青枯病高效生防資源、聯(lián)合使用多種生防因子、發(fā)展植煙土壤有益微生物區(qū)系調(diào)控技術(shù)，進(jìn)而有效控制青枯病提供新的線索。

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Pyrosequencing Analysis of Soil Bacteria Composition in Tobacco Bacterial Wilt Disease Nursery

CAO Yi，LU Ning，CHEN Xingjiang，MENG Jianyu，SHANG Shenghua

(Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang 550081，China)

In order to understand the relationship between soil bacterial community structure and tobacco bacterial wilt disease,the soil bacterial composition and diversity in tobacco bacterial wilt disease nursery were investigated by 454 pyrosequencing.The results indicated that a total of 1 963 effective reads were obtained from soil sample,which belonged to 14 phyla of bacteria,uncultured bacteria and unclassified bacteria.Proteobacteria,Acidobacteria,Chloroflexi,Acidobacteria,Planctomycetes,Actinobacteria and Gemmatimonadetes were dominant taxa,accounting for 29.91%,17.10%,13.73%,11.46%,7.08%,6.40% of the total bacterial groups in the soil,respectively.The lower abundance of Bacteroidetes and Actinobacteria might be associated with the occurrence of tobacco bacterial wilt disease.

tobacco； bacterial wilt disease； soil； bacteria flora； pyrosequence

2016-07-28

中國煙草總公司貴州省公司科技計劃項目(201603)

曹 毅(1982-)，男，云南會澤人，副研究員，博士，主要從事煙草植物保護(hù)和生物防治工作。 E-mail：yicao1001@163.com

S435.72

A

1004-3268(2017)03-0081-05