張建永 王嵐 梁日欣 楊濱

[摘要]該文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)及體外細(xì)胞驗(yàn)證的方法，對(duì)丹參山楂有效組分配伍（SC121）抗動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。根據(jù)SC121所含成分的結(jié)構(gòu)類型及藥效活性報(bào)道，選取丹酚酸B、丹參酮ⅡA、丹參素、表兒茶素及原花青素B2作為SC121的主要活性成分，用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選上述5個(gè)主要成分作用于心血管疾病的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)；結(jié)合KEGG和Uniprot數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行信號(hào)通路和生物途徑分析，預(yù)測(cè)其作用機(jī)制。 在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，建立體外細(xì)胞模型，觀察SC121對(duì)oxLDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （HUVEC）和巨噬細(xì)胞RAW2647損傷及泡沫化的保護(hù)作用。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，SC121可通過作用同一靶點(diǎn)或不同靶點(diǎn)發(fā)揮抗AS作用， 其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)PPAR，reninangiotensin system等多通路，參與炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)及脂質(zhì)生物合成和代謝等多生物途徑有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SC121可減輕oxLDL對(duì)HUVEC和RAW2647的損傷程度， 降低RAW2647細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，減少泡沫細(xì)胞面積，并呈一定的量效關(guān)系。即在體外細(xì)胞模型上，SC121可抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗氧化等，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，綜合闡釋了SC121抗AS的作用機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]丹參山楂有效組分配伍； 動(dòng)脈粥樣硬化； 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； HUVEC； RAW2647； 泡沫細(xì)胞

Explore antiatherosclerotic mechanism of component compatibility of

Danshen and Shanzha based on network pharmacology and cell level

ZHANG Jianyong1， 2， WANG Lan1， LIANG Rixin1*， YANG Bin1*

（1 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2 Pharmacy School， Zunyi Medical university， Zunyi 563009， China）

[Abstract]To explore the antiatherosclerotic mechanism of active component compatibility of Danshen and Shanzha （SC121） based on network pharmacology and in vitro research validation with cell model On one hand， according to the chemical structures and pharmacological activities of the compounds reported in Danshen and Shanzha， 5 compounds， ie， salvianolic acid B， tanshinone ⅡA， tanshinol， epicatechin and procyanidin B2 were chosen and used for network pharmacology analysis Then the TCMSP（http：//lspnwsuafeducn/tcmspphp）was used for finding the network targets for 5 compounds from SC121 The signaling pathway associated with cardiovascular disease was analyzed by KEGG mapping， the biological process associated with cardiovascular disease was analyzed by Uniprot And， the mechanism of SC121 was predicted by network pharmacology In vitro cell model was subsequently performed for validation HUVEC and RAW2647 cell injuries and foam cell formation were constructed by oxLDL， and the intervention effects of SC121 were assayed The result showed that SC121 not only alleviated the damage of HUVEC and RAW2647， lowered the ROS level， but also decreased the area of foam cell in a dosedependent manner， which indicated that SC121 could inhibit the damage of endothelial cells and lower the oxidative stress The experimental data validated the prediction of network pharmacology， and elucidated the mechanism of SC121′s effect on AS

[Key words]active component compatibility of Danshen and Shanzha； atherosclerosis； network pharmacology； HUVEC； RAW2647； foam cells

doi：10.4268/cjcmm20162319

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為許多心血管疾病的病理基礎(chǔ)， 是一個(gè)復(fù)雜的進(jìn)展性的病變過程，其發(fā)展過程包括了血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、巨噬細(xì)胞激活和平滑肌增殖和遷移等因素參與[1]。研究表明，在AS發(fā)生的早期階段，在各種致病因素的誘發(fā)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)釋放一系列黏附因子和趨化因子，促使血循環(huán)中的單核細(xì)胞黏附到血管壁，發(fā)生細(xì)胞黏附，遷移至血管內(nèi)膜，分化成巨噬細(xì)胞，進(jìn)而形成AS樣脂肪紋[2]。另一方面，巨噬細(xì)胞的激活也在AS發(fā)展過程中起到關(guān)鍵的作用，巨噬細(xì)胞被激活后，其引發(fā)的細(xì)胞毒和炎性反應(yīng)將被擴(kuò)大，產(chǎn)生大量的自由基和炎性因子[3]。因此，干預(yù)早期AS樣變化的血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)于抑制AS發(fā)展具有一定意義。

丹參山楂有效組分配伍（SC121）是課題組在前期工作的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的組分中藥方，由丹參水溶性提取物（DSA）、丹參脂溶性提取物（DSF）、山楂水溶性提取物（SZA）組成。整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SC121可減緩AS大鼠的病變過程，其作用機(jī)制可能與降低AS大鼠的血脂水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及抗炎作用等有關(guān)[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)水平研究藥物作用規(guī)律和機(jī)制的一種有效手段，已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病復(fù)方藥物的研究，為中藥復(fù)雜作用機(jī)制研究提供了新的思路[5]。眾多的研究結(jié)果表明，oxLDL是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要因素，可誘導(dǎo)產(chǎn)生黏附因子，導(dǎo)致白細(xì)胞聚集，加速AS的發(fā)展[6]。同時(shí)oxLDL可被巨噬細(xì)胞識(shí)別后吞噬，加重巨噬細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，形成泡沫細(xì)胞，是AS早期的典型病理變化[7]。因此，本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析丹參山楂組分配伍的作用機(jī)制，在此基礎(chǔ)上采用oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （human umbilical vein endothelial cells， HUVEC）和RAW2647損傷模型進(jìn)行驗(yàn)證，旨在明確SC121抗 AS 的作用機(jī)制，為SC121的深入開發(fā)研究提供線索。

1材料

小鼠RAW2647巨噬細(xì)胞系（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫）；HUVEC（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所崔紅玉惠贈(zèng)）；SC121[4]（取丹參水溶性提取物84 mg、丹參脂溶性提取物25 mg、山楂水溶性提取物128 mg， 混勻即得，自制）；Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)NWK0484，美國(guó)Thermo公司）；胎牛血清（批號(hào)121005，美國(guó)Gibco公司）；谷氨酰胺（Sigma公司，北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心分裝）；025%胰酶（批號(hào)1155732，美國(guó)Gibco公司）；DMSO （ACS級(jí)，美國(guó)Amereso公司）；MTT（Sigma 公司，北京科海榮京生物技術(shù)科技發(fā)展有限公司分裝）；oxLDL（批號(hào)20121007，質(zhì)量濃度1 g·L-1，北京協(xié)生生物技術(shù)有限公司）；H2O2（批號(hào)LE60M12，北京J&K Scientific公司）；油紅O（Sigma公司，北京科海榮京生物技術(shù)科技發(fā)展有限公司分裝）；DCFHDA ROS試劑盒（批號(hào)20120920，南京建成生物工程研究所）。

Varioskan Flash酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；SWCF2FD雙人單面超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；MCO15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；H2SH型恒溫水浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；LDZ408型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

2方法

21網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

211成分的選擇SC121由丹參水溶性提取物、丹參脂溶性提取物和山楂水溶性提取物組成。以丹酚酸B為代表的丹酚酸類成分和以丹參酮ⅡA為代表的丹參酮類成分分別是丹參水溶性和脂溶性提取物的主要化學(xué)成分及藥效成分[8]；表兒茶素和原花青素B2是山楂水溶性提取物的主要化學(xué)成分及藥效成分[910]；另外，丹酚酸類成分易水解生成丹參素。故在本研究中，將丹酚酸B、丹參酮ⅡA、丹參素、表兒茶素及原花青素B2作為SC121的主要活性成分，用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

212網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)分析將上述5個(gè)成分代入TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lspnwsuafeducn/tcmspphp#），TCMSP是一個(gè)全面的中藥成分系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫，用于查詢作用靶點(diǎn)等信息[11]。在TCMSP中獲取作用靶點(diǎn)，剔除非人源靶點(diǎn)，采用PharmGKb（https：//wwwpharmgkborg/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（http：//www.drugbank.ca/）等數(shù)據(jù)庫對(duì)網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)，獲得SC121抗AS的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)群。采用cytoscape 321構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析SC121的作用特點(diǎn)。

213網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制分析將上述確定的靶點(diǎn)帶入KEGG（http：//wwwkeggjp/）進(jìn)行通路分析，尋找與心血管疾病相關(guān)的通路，通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)一步求證，構(gòu)建靶點(diǎn)作用通路網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)整合Uniprot （http：//wwwuniprotorg/）中網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)參與的生物途徑，構(gòu)建靶點(diǎn)生物途徑網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而綜合分析SC121中5種主要成分抗AS的作用機(jī)制。

22細(xì)胞培養(yǎng)

221HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇HUVEC，接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入20% FBS DEMEM培養(yǎng)基（含1×105 U·L-1青霉素，01 g·L-1鏈霉素，20 mmol·L-1谷氨酰胺），置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日換液，2～3 d待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后，以025%胰酶EDTA消化傳代，常規(guī)凍存，3～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

222RAW2647細(xì)胞培養(yǎng)RAW2647細(xì)胞以10% FBS DEMEM高糖培養(yǎng)基（含1×105 U·L-1青霉素，01 g·L-1鏈霉素，20 mmol·L-1谷氨酰胺），置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液，保持細(xì)胞密度不大于70%。實(shí)驗(yàn)前用倒置顯微鏡觀察，狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞出現(xiàn)多足，則不能用于實(shí)驗(yàn)。

23SC121最大無毒濃度的篩選

231對(duì)HUVEC細(xì)胞的最大無毒濃度取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，胰酶消化后以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入120，60，30，15，75 mg·L-1的SC121，作用 24 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，以未給藥組（control，ctrl）的存活率為100%，計(jì)算給藥組的存活率。

232對(duì)RAW2647細(xì)胞的最大無毒濃度取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW2647細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右，換為無血清培養(yǎng)12 h后，分別給予500，250，120，60，30，15，75 mg·L-1的SC121，作用24 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，以ctrl組為對(duì)照，比較不同濃度給藥后細(xì)胞的存活率。

24SC121對(duì)oxLDL誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響

241SC121對(duì)不同濃度oxLDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷的影響oxLDL造模濃度參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[3]，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，胰酶EDTA消化，以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)分為6組（每組5個(gè)復(fù)孔）：空白對(duì)照組（ctrl組， 給予空白培養(yǎng)液）、oxLDL組（分別加入200，150 mg·L-1的oxLDL）、SC121組（質(zhì)量濃度分別為60，30，15，75 mg·L-1），其中SC121組預(yù)先給藥24 h，ctrl和oxLDL組在同等條件下給予等量的完全培養(yǎng)基。吸棄上清，分別加入終濃度為 200，150 mg·L-1的oxLDL，同時(shí)ctrl組給予等量的完全培養(yǎng)基，24 h后檢測(cè)不同給藥濃度的存活率。

242SC121對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的RAW2647損傷的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW2647細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右，換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，分別給予60，30，15，75 mg·L-1的SC121作用12 h，同時(shí)設(shè)ctrl組和oxLDL組，給予等量的培養(yǎng)液；12 h后棄上清，oxLDL組和各給藥組給予 200 mg·L-1 oxLDL，ctrl組給予等量的培養(yǎng)液，作用12 h后棄上清，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。

25SC121對(duì)oxLDL誘導(dǎo)RAW2647細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW2647細(xì)胞，以4×105個(gè)/mL的密度鋪至6孔板中，37 ℃過夜孵育24 h，更換成無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液饑餓12 h，無菌PBS洗滌2遍，每孔加入工作濃度5 μmol·L-1的DCFHDA（將10 mmol·L-1 DCFHDA以1∶1 000稀釋即得）1 mL，37 ℃孵育30 min，吸棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFHDA，分別加入60，30，15，75 mg·L-1SC121溶液預(yù)孵育6 h，吸棄上清，加入200 mg·L-1的oxLDL溶液孵育30 min后，測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度，計(jì)算ROS的含量。

26SC121對(duì)oxLDL誘導(dǎo)RAW2647泡沫細(xì)胞的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW2647細(xì)胞，接種于預(yù)先放入蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%，換為無血清的培養(yǎng)基饑餓12 h，去掉培養(yǎng)基，分為6組（n=4），oxLDL組、ctrl組和4個(gè)給藥組。4個(gè)給藥組中分別加入無血清配制的60，30，15，75 mg·L-1的SC121溶液預(yù)作用6 h，再加入50 mg·L-1的oxLDL溶液誘導(dǎo)18 h。同時(shí)設(shè)ctrl組（未加oxLDL及藥干預(yù)）給予無血清培養(yǎng)液，oxLDL組加50 mg·L-1oxLDL。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，備用。油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)積累。在光學(xué)顯微鏡下拍照，采用Image ProPlus 60 軟件計(jì)算泡沫細(xì)胞面積。

27統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 130軟件，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用Ttest，以P<005被認(rèn)為有顯著性差異，P<001被認(rèn)為有極顯著性差異。

3結(jié)果

31網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)SC121的作用機(jī)制

311成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析SC121中5個(gè)主要成分的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1，采用cytoscape自帶分析工具network analyzer 分析，結(jié)果表明，5個(gè)成分共作用于41個(gè)與心血管疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，平均每個(gè)成分118個(gè)網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，其中28個(gè)獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)（僅與1個(gè)成分連接），13個(gè)網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)（與2～3個(gè)成分連接），即SC121具有作用于同一靶點(diǎn)及不同靶點(diǎn)的綜合協(xié)同作用方式。

312靶點(diǎn)通路及靶點(diǎn)生物途徑網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及作用機(jī)制分析將靶點(diǎn)代入KEGG數(shù)據(jù)庫映射后，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，發(fā)現(xiàn)SC121

作用的靶點(diǎn)中32個(gè)可映射到與心血管相關(guān)通路29個(gè)，如與心血管疾病密切相關(guān)的過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivated receptor， PPAR）信號(hào)通路（PPAR siginaling pathway），花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism），腎素血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system）等，從網(wǎng)絡(luò)角度揭示了SC121抗AS的作用通路。

為了全面反映不同網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的作用，將41個(gè)網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)代入U(xiǎn)niprot后，構(gòu)建靶點(diǎn)生物途徑網(wǎng)絡(luò)，見圖3，提取到與心血管疾病密切相關(guān)的生物途徑共8個(gè)，其中與靶點(diǎn)連接度高的有炎癥反應(yīng)（inflammatory reaction）、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)（endothelial cell protection）、脂質(zhì)生物合成和代謝（lipid biosynthesis and metabolism）、巨噬細(xì)胞分化及泡沫化（macrophage derived foam cell differentiation）等，從網(wǎng)絡(luò)角度揭示了SC121抗AS的多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制。

32SC121對(duì)HUVEC和RAW2647的最大無毒濃度篩選

MTT結(jié)果見圖4，當(dāng)SC121質(zhì)量濃度達(dá)到120 mg·L-1時(shí)，抑制了HUVEC的生長(zhǎng)（P<005），故選擇SC121的最大無毒濃度為60 mg·L-1。類似地，質(zhì)量濃度為500，250，120 mg·L-1的SC121溶液作用于RAW2647后，細(xì)胞的存活率較ctrl組顯著降低（P<005）；當(dāng)SC121質(zhì)量濃度為60，30，15，75 mg·L-1時(shí)，可顯著升高細(xì)胞的存活率（P<005），因此選擇SC121的最大無毒濃度為60 mg·L-1，見圖5。

33SC121對(duì)不同濃度oxLDL損傷HUVEC的保護(hù)作用

與ctrl組比較，150 mg·L-1 oxLDL可顯著降低HUVEC的存活率（P<001）；預(yù)孵育24 h后，低濃度SC121 （75，15 mg·L-1） 對(duì)HUVEC存活率無明顯影響；高濃度SC121 （30，60 mg·L-1） 可升高HUVEC的存活率（P<005），見圖6。

36SC121對(duì)oxLDL誘導(dǎo)RAW2647泡沫細(xì)胞的干預(yù)作用

50 mg·L-1oxLDL作用18 h后，巨噬細(xì)胞內(nèi)被染上較強(qiáng)的紅色脂質(zhì)，巨噬細(xì)胞開始變形，體積變大；SC121預(yù)干預(yù)6 h的巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)沉積顯著降低，并呈明顯的量效關(guān)系，見圖9。采用Image ProPlus 60軟件計(jì)算泡沫細(xì)胞面積，oxLDL作用18 h后，oxLDL組的泡沫細(xì)胞面積顯著增加（P<001），不同濃度SC121干預(yù)后，泡沫細(xì)胞面積顯著減小（P<001），并呈一定的量效關(guān)系，其中，60 mg·L-1SC121效果最顯著，見圖10。

4討論

丹參山楂是治療心血管疾病的經(jīng)典藥對(duì)，臨床也多用其治療心血管疾病，課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二者配伍的水合煎劑可干預(yù)大鼠AS的形成，同時(shí)可降低血脂水平，提升抗氧化能力，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，丹參中水溶性組分、脂溶性組分和山楂水溶性組分是其抗AS的主要成分[9]，正交設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)3種組分不同比例配伍均具有抗AS作用，且不同配伍的作用優(yōu)勢(shì)不同，體現(xiàn)了中藥作用的多途徑特點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SC121是抗AS的較優(yōu)配伍[4]，但其在細(xì)胞水平上的作用尚不清楚。

本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了SC121中主要成分的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)丹酚酸B等5種成分可通過共享靶點(diǎn)和獨(dú)立靶點(diǎn)發(fā)揮抗AS作用，涉及到脂質(zhì)代謝、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)、炎性反應(yīng)等生物途徑及通路，部分功能已被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如丹酚酸B可減輕H2O2誘導(dǎo)的HUVEC損傷，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性[13]；原花青素B2可抑制脂多糖誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，同時(shí)具有較強(qiáng)抑制環(huán)氧合酶2活性的作用[14]。綜上可知， SC121可通過多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路及多生物途徑的方式協(xié)同抗AS。

在上述基礎(chǔ)上，本研究采用HUVEC和RAW2647細(xì)胞模型驗(yàn)證SC121的作用機(jī)制。本研究采用200 mg·L-1oxLDL誘導(dǎo)HUVEC損傷和RAW2647損傷，給藥后發(fā)現(xiàn)SC121可劑量依賴性地保護(hù)oxLDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷和RAW2647巨噬細(xì)胞損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SC121可抑制損傷細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，推測(cè)其保護(hù)巨噬細(xì)胞和抑制泡沫細(xì)胞形成的作用可能與抗氧化活性相關(guān)。為了進(jìn)一步探索其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了SC121對(duì)RAW2647泡沫細(xì)胞的影響，在研究中首先分別以200，150，100，50 mg·L-1 oxLDL來建立RAW2647泡沫細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以200～100 mg·L-1的oxLDL建模，模型細(xì)胞損傷較大，死亡較多，且損傷后出現(xiàn)脂質(zhì)泄露的現(xiàn)象，不利于觀察藥效，因此本研究采用50 mg·L-1oxLDL建立RAW2647泡沫細(xì)胞模型，RAW2647泡沫細(xì)胞可吞噬oxLDL，同時(shí)無泄漏發(fā)生，與文獻(xiàn)報(bào)道的濃度相似[15]。結(jié)果表明，不同濃度SC121均可抑制RAW2647的泡沫細(xì)胞面積，且呈一定的量效關(guān)系，提示抑制泡沫細(xì)胞形成是SC121抗AS的機(jī)制之一。 綜上，在體外細(xì)胞模型上，SC121可抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗炎及泡沫細(xì)胞的形成等，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)于下一步從蛋白分子水平上揭示SC121的抗AS作用機(jī)制具有重要意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Gleissner C A Translational atherosclerosis research： from experimental models to coronary artery disease in humans[J] Atherosclerosis，2016，248：110

[2]Aluganti N C， FernandezRuiz I， Selvarajan K， et al Atherosclerosis—do we know enough already to prevent it[J] Curr Opin Pharmacol， 2016， 27： 92

[3]Lu X Impact of macrophages in atherosclerosis [J] Curr Med Chem， 201623（18）：1926

[4]張建永， 晏仁義， 王嵐， 等 丹參山楂有效組分配伍抗動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究[J] 中國(guó)中藥雜志， 2013，38（12）：1987

[5]Ma X， Lv B， Li P， et al Identification of "multiple componentsmultiple targetsmultiple pathways" associated with Naoxintong capsule in the treatment of heart diseases using UPLC/QTOFMS and network pharmacology[J] Evid Based Complement Alternat Med， 2016， doi： 101155/2016/9468087

[6]Di P N， Formoso G， Pandolfi A Physiology and pathophysiology of oxLDL uptake by vascular wall cells in atherosclerosis[J] Vascul Pharmacol，2016，84：1

[7]Shen C M， Mao S J， Huang G S， et al Stimulation of smooth muscle cell proliferation by oxLDL and acetyl LDLinduced macrophagederived foam cells[J] Life Sci，2001，70（4）：443

[8]Su C Y， Ming Q L， Rahman K， et al Salvia miltiorrhiza： traditional medicinal uses， chemistry， and pharmacology[J] Chin J Nat Med， 2015， 13（3）：163

[9]Zhang J，Liang R， Wang L， et al Effects of an aqueous extract of Crataegus pinnatifida Bge var major NEBr fruit on experimental atherosclerosis in rats[J] J Ethnopharmacoly， 2013，148（2）：563

[10]Wu J， Peng W， Qin R， et al Crataegus pinnatifida： chemical constituents， pharmacology， and potential applications[J] Molecules，2014，19（2）：1685

[11]Ru J， Li P， Wang J， et al TCMSP： a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J] J Cheminformatics， 2014，6（1）：13

[12]王偉， 楊濱， 王嵐，等 丹參山楂藥對(duì)對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響[J] 中國(guó)中藥雜志，2011，36（6）：784

[13]Tang Y， Jacobi A， Vater C， et al Salvianolic acid B protects human endothelial progenitor cells against oxidative stressmediated dysfunction by modulating Akt/mTOR/4EBP1， p38 MAPK/ATF2， and ERK1/2 signaling pathways[J] Biochem Pharmacol，2014，90（1）：34

[14]MartinezMicaelo N， GonzalezAbuin N， Terra X， et al Omega3 docosahexaenoic acid and procyanidins inhibit cyclooxygenase activity and attenuate NFkappaB activation through a p105/p50 regulatory mechanism in macrophage inflammation [J] Biochem J，2012，441（2）：653

[15]Wang Y G， Yang T L Liraglutide reduces oxidized LDLinduced oxidative stress and fatty degeneration in Raw2647 cells involving the AMPK/SREBP1 pathway[J] J Geriatr Cardiol，2015，12（4）：410

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