羅敏，陳德經(jīng)，，*，代惠萍，江海，季曉輝

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中723001；2.陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中723001）

硒的檢測方法研究進展

羅敏1，陳德經(jīng)1，2，*，代惠萍2，江海2，季曉輝2

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中723001；2.陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中723001）

硒在自然界中以無機硒和有機硒兩種形式存在。主要介紹硒形態(tài)的前處理方法以及熒光法、石墨爐原子吸收光譜法、氫化物原子熒光、液相色譜法、毛細管電泳法、比色法及各光譜法聯(lián)用技術等不同檢測方法、原理進行歸納，同時在導電性、酶活性、酶聯(lián)免疫法方面有望成為有機硒的快速、準確、操作簡便的檢測方法，為硒的檢測技術開發(fā)提供理論基礎。

無機硒；有機硒；檢測技術；研究進展

硒作為人體不可缺少的微量元素之一，其在自然界中存在形式為無機硒和有機硒，無機硒主要為亞硒酸鹽與硒酸鹽形式存在，以四價硒和六價硒為主要化學形態(tài)，具有劇毒[1]。有機硒的存在形式通常是硒代氨基酸、硒蛋白、硒多肽、硒多糖等形式[2]，使用比較安全，營養(yǎng)價值較高，可易在人體內(nèi)所吸收利用。因此準確、高效的檢測有機硒與無機硒有著重要的意義。近年來，硒的檢測技術隨著含硒樣品種類的不同也越來越多，對于無機硒和有機硒的檢測通常有石墨爐原子吸收法、氫化物發(fā)生原子熒光光譜法、火焰原子吸收光度法、分光光度法、熒光法、液相色譜法、氣相色譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、吸附極譜法、催化極譜法、陽極溶出伏安法、陰極溶出伏安法、氫化物發(fā)生原子吸收法以及聯(lián)用技術等[3-4]。雖然檢測方法很多，但每種測定方法都有其各自的優(yōu)缺點?，F(xiàn)將不同的檢測方法的原理、方法及優(yōu)缺點分別闡述。

1 硒形態(tài)的前處理方法

1.1 浸提法

提取劑一般有水浸提、酸浸提（HNO3-H2O2-HC1、Tris-HCl、）、堿浸提（KOH）、鹽溶液浸提（2%NaCl）、醇浸提（70%CH3CH2OH）等，適用于無機硒和未結合到蛋白質中的有機硒小分子化合物，如硒酸鹽、亞硒酸鹽、甲基硒代半胱氨酸、γ-谷氨酸硒甲基硒代半胱氨酸等硒代氨基酸等水溶性的硒形態(tài)[5-8]。使用酸性試劑雖然可以提高提取效率，但是腐蝕性會對試樣有影響，其中Tris-HCl有致癌作用；堿性試劑也可降解硒化合物[9]。

1.2 酶解法

提取劑一般有淀粉酶、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纖維素酶、蛋白酶E、脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶等，適用于以硒代氨基酸或者硒肽的形式結合在蛋白質中的硒形態(tài)[10-13]。在溫和的環(huán)境下酶解法提取硒不僅具有較高效率，而且不破壞硒成分，在未來將成為提取硒形態(tài)的有效方法[9]。

2 無機硒的檢測方法

2.1 熒光法

熒光法的原理是將樣品在高氯酸與硝酸兩者混合進行加熱消化，使不同價態(tài)的硒轉化成為無機硒，在酸性環(huán)境下，使試樣中的Se6+還原成Se4+，再與2，3-二氨基萘（2，3-diaminonaphthalene，DAN）顯色劑發(fā)生反應的同時生成4，5-苯并苤硒腦，最后的萃取劑為環(huán)己烷。反應激發(fā)波長是376nm，發(fā)射波長為520nm[14-15]。黃高凌等[16]用熒光法測定硒含量，檢出限為0.22 μg/L、線性范圍為 1 μg/L～30 μg/L、相對標準偏差 RSD＜ 2.9%，該法靈敏度高，方法簡單迅速，但受萃取劑、溫度、pH值的影響，操作繁瑣費時，所用的試劑毒性大，檢測的是總硒含量，不能有效的對有機硒和無機硒分辨。

梁愛惠等[17]對其傳統(tǒng)的方法進行優(yōu)化，在硫酸條件下，將四價硒與還原劑反應，將其還原為硒化氫，再用KI3吸收硒化氫，使羅丹明6G較少的結合I3-而使羅丹明6G熒光強度變大，熒光測定波長為562 nm。激發(fā)波長為480 nm。該方法的檢出限為0.01 μg/mL，回收率在91.8%～107.1%之間。

2.2 石墨爐原子吸收光譜法

其原理是將樣品前處理后直接注射到石墨爐中，形成的基態(tài)原子躍遷到較高能態(tài)所需能量的頻率時，原子就產(chǎn)生共振吸收，再依據(jù)標準溶液測定硒含量，但在樣品的消解過程中溫度到400℃時會使硒蒸發(fā)，而損失一部分硒，測定不準確。因此使用基體改進技術來阻止硒的損失，它是往石墨爐或試樣溶液中加入某種化學試劑，來增加待測樣品溶液基體的揮發(fā)性，或提高待測易揮發(fā)元素的穩(wěn)定性，提高灰化溫度而消除或減小基體干擾，該方法靈敏度高，檢出限低，但檢出的是總硒含量，對有機硒的定量檢測不準確[18-19]。

梅燦輝[20]提出使用膠體鈀作為基體改進劑，樣品不需要經(jīng)過消解，只需要酸化與稀釋后可直接上機測定，利用膠體鈀-石墨爐原子吸收測定枸杞酒中硒含量，其檢出限為26.74 pg，RSD值＜10%，加標回收率為102.60%，線性回歸方程為Y=0.000 024x2+0.004 1x+0.017，相關系數(shù) R2=0.998 8。劉娟麗等[21]提出使用Pd（NO3）2作為基體改進劑，利用石墨爐原子吸收光譜在196 nm測定飼料中的硒，檢測限為0.33 μg/kg，回收率為95.0%～105.3%，硒含量在0～100 μg/kg成線性關系也取得較好的結果。

2.3 氫化物-原子熒光光譜法（hydride-generationatomic fluorescence spectrometry，HG-AFS）

在酸環(huán)境中將四價硒與還原劑硼氫化鉀或硼氫化鈉在氫化物系統(tǒng)中被還原成硒化氫，由氫氣和硒化氫與載氣氬氣帶入到原子化器，形成火焰，從而使硒元素被原子化，火焰中硒原子在空心硒陰極燈的照射下被激發(fā)，使基態(tài)硒被激發(fā)至高能態(tài)，再被活化回到基態(tài)時發(fā)射出熒光強度信號。在一定條件下產(chǎn)生的熒光強度與硒含量成正比[22-23]。

王世成等[24]使用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖溶液提取法分離鴨蛋中的有機硒和無機硒，采用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法檢測，再利用差減法檢測鴨蛋中無機硒和有機硒的含量，其無機硒的檢出限為 0.003 mg/kg，測定線性范圍為 2.0 μg/L～50 μg/L，相對標準偏差RSD為3.21%，加標回收率為82.8%～91.0%。

HG-AFS法光譜干擾少，譜線簡單，靈敏度和準確度高，檢出限低，適用于多種痕量元素的測定。采用差減法分析有機硒含量，這個是現(xiàn)行的標準GB 5009.93-2010《食品安全國家標準食品中硒的測定》[25]，但有機硒測定準確度差，對有機硒和無機硒的分離不準確。

2.4 電化學方法

電化學法主要包括催化極譜法、電位滴定法、陽極溶出伏安法、陰極溶出伏安法、離子選擇電極法，其每種方法硒的檢出限分別為（0.6、8、0.004、0.2、20μg/g）[26]。其硒的測定最常用的是催化極譜法與溶出伏安法，崔鵬[27]用催化極譜法測定硒的含量，檢出限2.0 μg/L，相對標準偏差RSD為3.0%～1.6%，加標回收回收率104%～92%。該方法其靈敏度已達到或大于熒光法原子熒光法測定硒，準確度高、儀器簡單、分析速度快和應用范圍廣但操作繁瑣，適用范圍窄。

2.5 比色法

在酸性環(huán)境下Se4+與3，3-二氨基聯(lián)苯胺試劑顯色反應生成黃色化合物，使用甲苯在pH約為7時萃取，樣品需經(jīng)過加入混酸加熱消解使樣品中硒的化合價消解為合適的價態(tài)即四價硒，再經(jīng)鹽酸反應使其六價硒最終還原為四價硒，再進行比色定量測定總硒含量。Na2-EDTA可消除樣品中其它重金屬離子，如：銅、鐵等其干擾，此法據(jù)報道最低檢出限為2.5 μg/L，測定上限為50 μg/L，靈敏度較低，檢測限不能滿足微量分析要求[28]。

3 有機硒的檢測

3.1 高效液相色譜法

硒代甲硫氨酸、硒代蛋氨酸及其他氨基酸與4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，可產(chǎn)生的衍生物具有紫外吸收，再運用高效液相色譜儀分離，在240 nm處，進行紫外檢測。此方法具有較高的精密度、低的檢出限、檢出成本低、操作簡便，但目標物的出峰時間太晚，耽誤檢測效率，氨基酸干擾較大[29-30]。李紅衛(wèi)等[31]通過該法檢測富硒米曲霉中有機硒形態(tài)，其硒代胱氨酸檢出限（RSN=3）為0.680 mg/L，定量限（RSN=10）為2.244 mg/L，線性范圍為 5.0 mg/L～100 mg/L，加標回收率為94.8%～105.8%。

3.2 氣相色譜法

易揮發(fā)的硒化合物如二甲基硒、二甲基二硒適合使用氣相色譜檢測，難揮發(fā)的硒酸鹽及硒代氨基酸需要被衍生成揮發(fā)性物質，再經(jīng)萃取和色譜分離進行檢測。張修景等[32]在用氣相色譜法測定羅漢參中硒的含量時，將樣品加入混酸微波消解，再經(jīng)甲苯萃取和毛細管色譜柱分離，再經(jīng)檢測器進行硒的定性及定量分析，其最低檢出限為0.003 mg/L，相對標準偏差（n=5）小于 1.1% ，在 0.005 μg/mL～0.025 μg/mL 硒含量范圍內(nèi)線性關系良好；加標回收率在98.0%～100.7%范圍內(nèi)。對于揮發(fā)性有機硒化合物的分析比較適用，具有較高的準確度、靈敏度高、精密度好、高選擇性，但與試劑的選擇密切相關。

3.3 高壓液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜（high performance liquid chromatography-hydride generationatomic flurescence spectrometry，HPLC-HG-AFS）

目前礦物質元素化學形態(tài)檢測的主要方法是聯(lián)用技術，高效液相色譜與靈敏度較高的氫化物發(fā)生-原子熒光光譜聯(lián)用應用于硒的各種形態(tài)分析，已成為一個很好的檢測儀器。尚德榮等[33]利用HPLC-HG-AFS測定水產(chǎn)品中硒的賦存形態(tài)時對樣品使用恒溫超聲提取，待測物使用PRP-X100陰離子交換柱，以pH值為6.0的磷酸鹽緩沖液為流動相，利用高效液相色譜對試樣中的硒代胱氨酸（SeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、四價硒（SeIV）、六價硒（SeVI）分離后，使用氫化物原子熒光光譜進行檢測，其檢出限分別為1.2、0.8、1.4、2.1 ng/mL，RSD小于4.0%，線性相關系數(shù)均大于0.995，測試樣品的平均回收率都在86.6%以上。該法靈敏度高，檢出限低，光譜干擾小，但樣品預處理繁瑣，分析成本較高。但目前只能分析3種硒形態(tài)，亞硒酸鹽、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸[34-35]，因此，該技術可在優(yōu)化選擇適宜的浸提試劑，通過嘗試震蕩、超聲、微波萃取等輔助浸提方法提取樣品，得到不同基質的前處理方法上，建立快速、靈敏度高、準確性好、重現(xiàn)性好、分離度好的分離檢測方法有待進一步研究。

3.4 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（high performance liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術

HPLC的分離技術能達到高效分離的效果，特別適用于熱穩(wěn)定性較差、大的分子量、較強的極性物質的分離，和具有極低的檢出限、干擾少、快速、精密度高等優(yōu)點的ICP-MS聯(lián)用，可準確分析微量元素同位素[36-37]。此技術不用試樣的前處理，可直接測定各種氧化態(tài)硒[38]。吳雅穎等[39]將一定量的筍樣品粉末置于用3 mL超純水溶解20 mg鏈酶蛋白酶E后，37℃超聲提取30 min，離心分離后，選用裝有碰撞池的ICP-MS儀器色譜柱為Hamilton PRP X-100作為檢測器，流動相為pH4.72檸檬酸溶液，流速為1.0 mL/min。采用超聲波輔助酶提法提取雷竹筍硒形態(tài)，利用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術分離測定有機硒，檢出限在0.4 g/L～4.6 g/L，6種硒形態(tài)的加標回收率在80%～117%。

該方法有較強的分離能力、高效、精準、分析速度快等優(yōu)點，主要用于形態(tài)分析，適合于食品中硒酸鹽（Se VI）、亞硒酸鹽（Se IV）、硒代蛋氨酸（Se Met）、硒代胱氨酸（Se Cys2）、甲基硒代半胱氨酸（Me Se Cys）和硒代乙硫氨酸（Se Et）的定性定量分析，但儀器價格太高，在實際應用中被限制[40]。

3.5 毛細管電泳—電感耦合等離子體質譜

毛細管電泳可分離不同樣品的形態(tài)，是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術，毛細管電泳法中電泳的重現(xiàn)性不高，影響定性定量結果，因此使用聯(lián)用技術組成具有高靈敏度與選擇性的分離方法。鄭進平使用毛細管電泳—電感耦合等離子體質譜（capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry，CE-ICP-MS）聯(lián)用分析方法，方法檢測限達到0.2ngSe/mL～0.9ngSe/mL，RSD（n=6）為 3%～5%，加標回收率為80%～102%[41]。

4 其它方法

隨著科學技術的發(fā)展與進步，在提取，樣品的處理及分析方法也隨之變化，而出現(xiàn)的一些新方法在準確度，靈敏性，選擇性上也各有特色。如：超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛奶中游離硒代蛋氨酸，其Se Met線性范圍為0.5 ng/mL～100 ng/mL，方法的定量下限為0.5 ng/mL。定量下限準確度87.14%，RSD為3.95%，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法具有重復性好、特異性好、分析時間短、靈敏度高、操作簡單的優(yōu)點。但所需儀器設備儀器昂貴，普及度不高，使用受到限制[42]。濁點萃取-共振瑞利散射法，其原理是萃取硒與吡咯啶二硫代氨基甲酸銨（pyrrolidine dithio charboxylic acid ammer，PDCA）生成穩(wěn)定的螯合物表面活性劑相，并利用表面活性劑相在470 nm有最大吸收峰來檢測硒含量，王梅利用該法測定富硒螺旋藻片中的硒檢出限為0.006 3 μg/mL，RSD為2.65%，加標回收率為105.8%，該法檢出限低，干擾小，但只能檢測四價硒[43]。

5 展望

采用差減法分析有機硒含量，這個是現(xiàn)行的標準，但對有機硒測定準確度差，對有機硒和無機硒的分離不準確。同時樣品處理過程中需要大量的強酸消解（體積比1∶1鹽酸；體積比4∶1混合酸等），過程繁瑣。所使用的測定儀器要求門檻較高，而在未來有機硒的快速檢測中依據(jù)硒在光照下的導電性差異[44-45]，探討光照與硒的含量和導電性的關系，優(yōu)化條件，定性定量分析有機硒。其次依據(jù)有機硒可使GSH-Px酶活性提高[46-48]，探討酶促反應條件下的生化檢測技術定性定量鑒別無機硒和有機硒。再次采用生物免疫學方法檢測有機硒的含量，如制備硒蛋氨酸單克隆抗體，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[49-51]直接區(qū)分有機硒與無機硒，有望成為分析有機硒和無機硒的新型技術，并能夠滿足再現(xiàn)性好、精確度高、檢出限較高、方法操作簡便，檢驗檢測成本低，能夠定量準確檢測出硒氨基酸、硒蛋白、硒核酸以及硒多糖等多種化合物結合形式的有機硒含量，且實用性廣泛的快速檢測方法。

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Research Progress of Detection Methods of Selenium

LUO Min1，CHEN De-jing1，2，*，DAI HUI-ping2，JIANG Hai2，JI XIAO-hui2
（1.College of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China；2.Bio-resource Key Laboratory of Shaanxi Province，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China）

Selenium exists in nature in two forms：inorganic selenium and organic selenium.Mainly introduces the pretreatment method of selenium form and the different detection methods，such as fluorescence method,graphite furnace atomic absorption spectrometry，hydride atomic fluorescence,liquid chromatography，capillary electrophoresis，colorimetric method and spectroscopy.It is expected to be a rapid,accurate and easy method for the determination of organic selenium in the aspects of conductivity，enzyme activity and enzyme-linked immunoassay，and provided a theoretical basis for the development of selenium detection technology.

inorganic selenium；organic selenium；detection methods；research progress

2016-12-24

陜西省農(nóng)業(yè)攻關項目（2015NY012）

羅敏（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品生物化學。

*通信作者：陳德經(jīng)（1961—），男（漢），教授，碩士生導師，研究方向：食品生物技術。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.041