鄧 琳 李加重

（1天津市靜海區(qū)瀛海學(xué)校 天津 301600 2天津市靜海區(qū)教育教學(xué)研究室 天津 301600）

“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化”實驗是人教版高中生物學(xué)必修2“染色體變異”一節(jié)中的實驗內(nèi)容。該實驗的目的是幫助學(xué)生理解低溫誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目變化的作用機(jī)制，有利于了解染色體變異在實際生活中的應(yīng)用。但是在實際教學(xué)中，按照教材介紹的步驟進(jìn)行實驗時遇到了很多問題，例如成功率低、觀察效果不理想等，不利于學(xué)生對誘導(dǎo)機(jī)制形成直觀感受與認(rèn)知。分析原因，一方面是低溫誘導(dǎo)的溫度和處理時間的選擇存在爭議；另一方面是在制作裝片的過程中對解離、染色等環(huán)節(jié)條件的控制有待改進(jìn)。因此筆者組織學(xué)生在實際操作中對該實驗進(jìn)行了進(jìn)一步的探究和改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 結(jié)合教材，實驗小組本著實驗材料易獲得、操作簡單、染色體條數(shù)少、易觀察等原則，確定了幾種實驗材料：蠶豆（2n=12）、洋蔥（2n=16）、豌豆（2n=14）、大蔥、大蒜。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 培養(yǎng)根尖 將蠶豆和豌豆種子在清水中浸泡，待種子泡發(fā)后放入鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中于室溫下培養(yǎng)。因氣溫較高，培養(yǎng)皿置于無光陰涼處，且每天換水2次。若實驗室具備恒溫箱，可將培養(yǎng)皿放入10℃中培養(yǎng)，每2天換一次水（水浸沒種子的1/3或1/2）。洋蔥需在實驗前去除老根和干枯的鱗片葉，放入盛有清水的容器中，水以沒過洋蔥根部為宜，于室溫下培養(yǎng)。

1.2.2 低溫誘導(dǎo)處理 待實驗材料根的長度達(dá)到1 cm左右時，將實驗材料平均分為3組，分別置于2℃、4℃的冰箱中進(jìn)行低溫處理；對照組于室溫下進(jìn)行培養(yǎng)。低溫處理時長控制在36 h（換水時注意用相應(yīng)溫度的水以減少實驗誤差）。低溫處理后恢復(fù)常溫培養(yǎng)10 h。

1.2.3 材料處理制作裝片

1）固定和解離：借助卡諾氏液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）進(jìn)入組織和細(xì)胞并將其殺死，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物盡可能保持完整，還能增強(qiáng)染色體的染色效果。用解離液（15%HCl∶95%酒精=1∶1）去除細(xì)胞壁間的果膠使細(xì)胞壁軟化，并使細(xì)胞間中膠層物質(zhì)溶解便于細(xì)胞分離。依據(jù)教材實驗步驟［1］，取 0.5～1 cm 的根尖（可取 1 cm，便于在之后的操作中取放，在染色時再將多余部分去除）放入卡諾氏液中浸泡。教材要求固定0.5～1 h，解離3～5 min，因考慮解離效果受到自身材料、溫度和時長及固定效果的影響［2］，實驗小組學(xué)生將固定和解離結(jié)合考慮，設(shè)置多組對比實驗。通過不斷調(diào)整固定和解離的時間發(fā)現(xiàn)，固定時間控制在0.5 h對于之后的操作效果更好。固定后的材料用95%的酒精進(jìn)行充分沖洗，以免影響解離效果。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，固定過程中借助恒溫箱將溫度設(shè)定為25℃，濕度40%。解離效果蠶豆以25～30 min為宜；豌豆15 min為宜；洋蔥 10 min為宜（材料保持完整形態(tài)，染色時可被搗碎，壓片時蓋上蓋玻片即可將材料壓碎使細(xì)胞分散開）。解離時間不足會導(dǎo)致壓片不能成霧狀、細(xì)胞不能充分分散重疊度高、染色不充分等情況。

2）漂洗：依據(jù)教材介紹的實驗步驟，解離后使用清水對實驗材料進(jìn)行漂洗以去除殘留的解離液，防止解離過度。注意應(yīng)漂洗3次，每次2～3 min，且注意動作力度，防止破壞根尖形態(tài)。

3）染色：可選染液包括龍膽紫、醋酸洋紅和改良苯酚品紅溶液。本次實驗選擇龍膽紫（缺點在于易對細(xì)胞質(zhì)染色，染色體觀察不清，增大觀察難度）和醋酸洋紅（缺點在于配制復(fù)雜，購買配制好的染液價格昂貴）。采取2種染色方法，其一將實驗材料浸泡在染液中3～5 min；其二在載玻片上滴一滴清水，將已漂洗的實驗材料置于清水中，滴加一滴染液，再用鑷子將根尖輕輕搗碎至組織分散，染色 2 min［3］（通過比較，學(xué)生發(fā)現(xiàn)第 2 種方法染色更快、更均勻）。

4）蓋上蓋玻片，在蓋玻片上鋪吸水紙并加一層載玻片，輕輕按壓，注意力度。也可用鑷子鈍頭輕輕敲打蓋玻片下的材料，使材料分散成霧狀。用高倍鏡觀察細(xì)胞的染色體情況。

2 實驗結(jié)果

2.1 洋蔥和蠶豆實驗效果的比較 實驗操作中發(fā)現(xiàn)，蠶豆根尖因培養(yǎng)時間較長、根比較粗壯、細(xì)胞質(zhì)豐富等原因，使得現(xiàn)有實驗條件下不利于染色體數(shù)目的觀察。豌豆根尖質(zhì)地堅硬，不易制作壓片。與前2種材料相比，洋蔥根的培養(yǎng)時間較短、分裂旺盛、便于染色觀察。根據(jù)實驗結(jié)果觀察，洋蔥試驗比較容易獲得對比度較好的染色體（染色質(zhì)）染色效果。

2.2 洋蔥根尖于龍膽紫、醋酸洋紅染液染色效果的比較（圖1、圖2，本文附圖見封四）。

如圖可見，0.02%龍膽紫染液較0.01%龍膽紫染液染色效果深，影響染色體（染色質(zhì)）觀察，醋酸洋紅染液染色效果清晰、明亮，可清晰地觀察到細(xì)胞中染色體（染色質(zhì)）的分布情況。

2.3 蠶豆、洋蔥根尖在不同處理條件下的實驗結(jié)果

1）蠶豆在 2℃、4℃條件下培養(yǎng)36 h，然后在室溫培養(yǎng)10 h，隨后鏡檢，分析實驗效果（圖3）可見，細(xì)胞分裂的中期和后期，部分細(xì)胞大小和染色區(qū)域面積明顯較大。因染色條件不易把握，不易觀察到清晰的分裂前期圖像和染色體數(shù)量加倍的現(xiàn)象。

2）洋蔥根尖 2℃、4℃條件下培養(yǎng) 36 h，然后在室溫培養(yǎng)10 h，隨后鏡檢。結(jié)果（圖4、圖5）顯示，2種溫度誘導(dǎo)處理后再進(jìn)行常溫培養(yǎng)的根尖，細(xì)胞分裂均比較旺盛，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)染色體數(shù)目加倍的現(xiàn)象。其中，4℃條件下能觀察到根尖細(xì)胞分裂更旺盛，說明洋蔥在這樣的誘導(dǎo)條件下實驗效果相對更好。

3 討論和分析

本次實驗在實驗前學(xué)生按教材過程進(jìn)行實驗操作，針對操作中發(fā)現(xiàn)的問題對實驗過程進(jìn)行了分析和討論，并分組進(jìn)行實驗設(shè)計。針對實驗材料、原理、自變量和因變量進(jìn)行了設(shè)定，例如以溫度為自變量，以誘導(dǎo)時間為自變量等。

3．1 對低溫范圍的設(shè)定 在操作中要將溫度控制在多少度才能更好地使植物細(xì)胞發(fā)生染色體數(shù)目變化？教材中要求將溫度設(shè)定在4℃，但學(xué)生對“低溫”這一概念存在許多疑問。在進(jìn)行低溫誘導(dǎo)研究時，通過分組實驗，學(xué)生將溫度分別控制在2℃、4℃。對于學(xué)生提出的為何不能將溫度設(shè)置在零下，筆者保留了問題，要求學(xué)生參考低溫誘導(dǎo)染色體加倍和酶活性原理查閱相關(guān)資料進(jìn)行思考。學(xué)生經(jīng)實際培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，0℃誘導(dǎo)條件下根尖出現(xiàn)凍害變黑、變軟，不能用于鏡檢。

3.2 對低溫處理時間的探究 學(xué)生通過查閱低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化的原理可知，低溫阻礙細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)的進(jìn)行，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂時紡錘體的形成途徑受阻，以致影響子染色體被拉向細(xì)胞兩極，使細(xì)胞不能分裂成2個子細(xì)胞，于是植物細(xì)胞染色體數(shù)目加倍。觀察染色體數(shù)目的最佳時期是細(xì)胞分裂的中期。因此，要在低溫條件下處理多長時間成為另一個重要問題。學(xué)生討論得出答案：只有當(dāng)細(xì)胞分裂進(jìn)入到第2個細(xì)胞周期的中期時才能確保觀察比較低溫誘導(dǎo)染色體數(shù)目變化是否成功。因此低溫處理時長至少需要長于1個細(xì)胞周期。其次，低溫降低酶的活性，細(xì)胞代謝水平整體下降，分裂速度變緩，使得細(xì)胞周期延長。筆者提供常溫下蠶豆根尖的細(xì)胞周期為17.3 h［4］，洋蔥根尖的細(xì)胞周期大于12 h，因此，實驗小組決定按教材要求將低溫處理時間設(shè)定為36 h。

3．3 實驗中如何確定染色體數(shù)目發(fā)生變化的細(xì)胞 為便于比較細(xì)胞中染色體數(shù)目是否發(fā)生變化，進(jìn)行常溫培養(yǎng)對照實驗，用以觀察不經(jīng)低溫誘導(dǎo)的根尖分生區(qū)細(xì)胞中染色體數(shù)目及分布情況。但在實際觀察中很難數(shù)清染色體條數(shù)。

在實驗裝片的觀察中，學(xué)生發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞中存在2個距離很近且清晰的細(xì)胞核（圖6、圖7），不同于分裂末期的細(xì)胞。學(xué)生提出質(zhì)疑后，筆者組織學(xué)生對比觀察對照組材料裝片和實驗組裝片，設(shè)置表格記錄雙核細(xì)胞出現(xiàn)的頻率。比較發(fā)現(xiàn)只有實驗組裝片存在這一現(xiàn)象，就此問題學(xué)生深入思考雙細(xì)胞核形成的原因。經(jīng)查閱資料和分析得出，低溫誘導(dǎo)過程中細(xì)胞分裂并未阻斷細(xì)胞的分裂行為而使分裂停止在前期或中期。由于低溫使紡錘體裝配組件受到影響，使分開的染色單體不能拉向細(xì)胞兩極，也未形成2個子細(xì)胞。對于已經(jīng)進(jìn)入后期但染色體未到達(dá)兩極的細(xì)胞來說，子染色體將停止運(yùn)動隨后形成2個新的細(xì)胞核，同時低溫影響細(xì)胞質(zhì)分裂2個子核保留在同一個母細(xì)胞中［5］。學(xué)生提出可利用雙核細(xì)胞作為“低溫誘導(dǎo)細(xì)胞染色體數(shù)目變化”的實驗輔助觀察指標(biāo)，提高實驗的成功率。

3．4 實驗中一些細(xì)節(jié)問題 實驗小組學(xué)生通過實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過低溫處理的根尖直接進(jìn)行實驗，可觀察到的進(jìn)行細(xì)胞分裂的細(xì)胞較少。分析原因可能是低溫處理后，細(xì)胞未能進(jìn)入新的分裂期，即出現(xiàn)細(xì)胞同步化［6］。針對這一問題，選擇在低溫誘導(dǎo)后恢復(fù)常溫培養(yǎng)使細(xì)胞分裂再次進(jìn)行。恢復(fù)常溫培養(yǎng)的時間嚴(yán)格控制在實驗材料的1個細(xì)胞周期以內(nèi)即10 h，從而使低溫誘導(dǎo)后的細(xì)胞再次出現(xiàn)一個細(xì)胞分裂的高峰。

細(xì)胞分裂在24 h內(nèi)旺盛程度不同，考慮細(xì)胞分裂于上午10時至下午14時較旺盛，選擇將放入冰箱進(jìn)行低溫誘導(dǎo)的時間定為上午10時。對誘導(dǎo)處理后的細(xì)胞進(jìn)行實驗觀察也應(yīng)將時間選擇在上午10時左右進(jìn)行。

4 結(jié)論

本實驗通過學(xué)生分組探究，對“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目的變化”實驗中的一些細(xì)節(jié)進(jìn)行了補(bǔ)充，對固定、解離、染色等常規(guī)操作步驟做了更詳細(xì)的處理，以提高實驗的成功率。染色體觀察效果證明，雖然蠶豆的染色體數(shù)目少、細(xì)胞大，但在高中實驗中洋蔥相比于蠶豆、豌豆等實驗材料更理想，具有操作簡單、解離時間短、染色體染色效果清晰等優(yōu)點。根據(jù)實驗，醋酸洋紅染色較龍膽紫更易獲得對比度高的染色體(染色質(zhì))圖像；考慮使用安全和經(jīng)濟(jì)條件等因素，可使用0.01%龍膽紫染液。

需要說明的是，蠶豆、洋蔥等都是經(jīng)過許多人探索，適于教學(xué)實驗的材料；龍膽紫、醋酸洋紅等均被長期用于染色體顯色實驗。有經(jīng)驗、有水平的實驗者均可利用這些材料、方法獲得高質(zhì)量實驗結(jié)果。所以，這里僅從探究角度進(jìn)行分析，所獲的經(jīng)驗在同等條件下具有參考價值和教學(xué)意義，但不試圖無條件推廣。相反，同行在此基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改進(jìn)（甚至糾偏）一定更有價值。

本實驗仍有許多改進(jìn)之處。例如：將實驗的誘導(dǎo)溫度和時間進(jìn)行更細(xì)化處理；在處理實驗結(jié)果時，可通過列表對細(xì)胞分裂指數(shù)進(jìn)行計算和比較，從而更準(zhǔn)確探究更好地誘導(dǎo)染色體數(shù)量變化的條件。筆者將進(jìn)一步嘗試，并組織學(xué)生設(shè)置后續(xù)實驗方案，繼續(xù)探究。

本次實驗在教師的引導(dǎo)和提示下，學(xué)生充分參與實驗的探究和思考，更好地體現(xiàn)了學(xué)生的主導(dǎo)地位，從而培養(yǎng)學(xué)生的實驗思維和實驗?zāi)芰?，逐步養(yǎng)成不斷質(zhì)疑、不斷研究的學(xué)習(xí)習(xí)慣。

［1]人民教育出版社，課程教材研究所，生物課程教材研究開發(fā)中心.生物：必修2.北京：人民教育出版社，2007.

［2]郁建強(qiáng)，陸文初.植物細(xì)胞有絲分裂實驗技術(shù)的改進(jìn).實驗室研究與探索，2001（6）：70.

［3]林荔，肖義軍，詹曉梅.低溫誘導(dǎo)植物細(xì)胞數(shù)目變化實驗的改進(jìn).中學(xué)生物學(xué)，2012，28（1）：45.

［4]顧文波.細(xì)胞周期與細(xì)胞同步化.生物學(xué)教學(xué)，2011，36（6）：54.

［5]利榮千.植物細(xì)胞學(xué)專題講座：第2講：植物細(xì)胞周期與細(xì)胞的異常分裂.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1980（8）：35.

［6]周愛文，柯鐵，梅興國.低溫誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞同步化的研究.武漢化工學(xué)院學(xué)報，2001，34（1）：12.