王 巍，付茂忠，唐 慧，甘 佳，方東輝，王 淮，易 軍

（四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066）

綜述與專論

體細(xì)胞核移植技術(shù)的研究進(jìn)展

王 巍，付茂忠，唐 慧，甘 佳，方東輝，王 淮，易 軍

（四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066）

體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因法效率高、成本低，目前已經(jīng)成為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物極為重要的方法。但該項(xiàng)技術(shù)的成功率較低，而且許多克隆動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)胎兒過度生長(zhǎng)、出生前死亡、出生后生長(zhǎng)異常等病理反應(yīng)。文章以核移植生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，重點(diǎn)探討了改進(jìn)型核移植技術(shù)（OSM）在操作方法方面的改進(jìn)研究，分析了影響核移植成功率的影響因素，為核移植技術(shù)的進(jìn)一步完善提供了理論基礎(chǔ)。

體細(xì)胞核移植；供體；受體；胚胎

經(jīng)歷了數(shù)十年的發(fā)展，體細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)成為一種較成熟的轉(zhuǎn)基因手段。1952年Briggs等［1］首次進(jìn)行了細(xì)胞核移植試驗(yàn)并獲得了成功，他們將青蛙囊胚期的細(xì)胞核移入去核卵中，經(jīng)過正常卵裂發(fā)育成蝌蚪。由此開辟了高等動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究的新思路。1983年，McGrath等［2］利用顯微操作技術(shù)與細(xì)胞融合技術(shù)成功培育出克隆小鼠。該技術(shù)基本避免了傳統(tǒng)移核針穿刺細(xì)胞膜時(shí)造成的損傷，開創(chuàng)了全新的哺乳動(dòng)物核移植方法。此后，該技術(shù)被大量應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的胚胎克隆中。1997年，Wilmut等［3］利用綿羊乳腺細(xì)胞進(jìn)行核移植試驗(yàn)，并成功地獲得了世界上第一只體細(xì)胞克隆綿羊——多利（Doly）。這一成果證明高度分化的體細(xì)胞仍具有全能性，推動(dòng)哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)邁向應(yīng)用領(lǐng)域。基因修飾與核移植技術(shù)的結(jié)合為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)提供了更加高效快捷的途徑，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法將某基因整合到細(xì)胞核中，再將此類細(xì)胞篩選出來，把這些細(xì)胞核轉(zhuǎn)入到去核卵母細(xì)胞中，建立重組胚（見圖1），產(chǎn)生的胚胎中所有的細(xì)胞均攜帶這種基因。但該項(xiàng)技術(shù)的成功率較低，而且許多克隆動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)為胎兒過度生長(zhǎng)、出生前死亡、出生后生長(zhǎng)異常等病理反應(yīng)。為了探尋影響動(dòng)物克隆效率的原因，研究者們不斷尋找更為簡(jiǎn)便、有效的方法對(duì)細(xì)胞核移植技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行改善，并且加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞核移植理論的關(guān)注度，在細(xì)胞分化、核質(zhì)互作、核重編程以及與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的基因在克隆動(dòng)物中的表達(dá)情況等相關(guān)基礎(chǔ)理論方面開展了大量的研究。

1 核移植的理論基礎(chǔ)

核移植所依賴的理論基礎(chǔ)是基于同一胚胎或細(xì)胞系的所有細(xì)胞核遺傳信息都與受精卵相同，應(yīng)該同樣具有指導(dǎo)個(gè)體發(fā)育的全部潛能。隨著胚胎的發(fā)育與細(xì)胞分化的發(fā)生，細(xì)胞核的某些基因組發(fā)生了變化，導(dǎo)致這些基因組不能再恢復(fù)到原有狀態(tài)，從而使得細(xì)胞核失去了全能性（見圖2）。目前的核移植程序可使初步分化的胚細(xì)胞核和已分化的體細(xì)胞核發(fā)生發(fā)育程序的去分化和發(fā)育程序再分化，使其恢復(fù)到受精時(shí)的狀態(tài)以重新指導(dǎo)胚胎發(fā)育至正常個(gè)體［5］。為了使供體核能夠完全的再程序化，關(guān)于重構(gòu)胚中去甲基化和再甲基化的規(guī)律及其在不同物種之間的差別，成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)中生物活性分子的種類及其對(duì)于已分化的體細(xì)胞核再程序化的作用，核質(zhì)互作的原理及其對(duì)重構(gòu)胚發(fā)育的影響等方面的理論成為研究的重點(diǎn)。

圖1 克隆胚胎的構(gòu)建過程［4］

圖2 胚胎細(xì)胞分化過程［4］

2 OSM核移植方法

通常在進(jìn)行核移植時(shí)，影響核移植的主要因素為核重編程［6］、培養(yǎng)條件、卵母細(xì)胞的質(zhì)量［7］以及去除卵母細(xì)胞染色質(zhì)的技術(shù)［8］。傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植（SCNT）的技術(shù)難點(diǎn)在去核時(shí)，清空處于減數(shù)分裂階段卵母細(xì)胞的中心體蛋白和染色質(zhì)，并使其接受來自供體細(xì)胞的不完全的有絲分裂結(jié)構(gòu)，這使得大部分重構(gòu)胚因不能由母源控制過渡到胚胎控制階段而停止卵裂［9-11］。OSM一步微注射法在卵母細(xì)胞活化前將外源性有絲分裂細(xì)胞核注射到未激活的卵母細(xì)胞中，再用微操作儀去除減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞核［12］。該技術(shù)避免了卵母胚胎暴露于Hoechst33342核染色劑和UV照射，減少了卵母胚胎的化學(xué)和物理?yè)p傷，其去除的卵母細(xì)胞胞質(zhì)極少，保證了胞質(zhì)內(nèi)參與核重編程因子的效應(yīng)［13］，該技術(shù)操作步驟少、時(shí)間短、降低了卵母細(xì)胞在移核時(shí)活化的可能性，提高了核移植成功率。Zhou等［14］比較了電融合法和一步微操作法，發(fā)現(xiàn)一步微操作法獲得的重組胚發(fā)育到囊胚的比例較電融合法高，且囊胚的發(fā)育更為正常。根據(jù)重組胚發(fā)育情況，不同核供體細(xì)胞優(yōu)先選擇的轉(zhuǎn)核方法各不相同。羊膜上皮細(xì)胞作為核供體細(xì)胞時(shí)用電融合方法建立的重組胚發(fā)育情況較好，而胚胎成纖維細(xì)胞作核供體細(xì)胞時(shí)用一步微注射方法建立的重組胚發(fā)育情況更好［15］。

3 重構(gòu)胚的激活

重構(gòu)胚最常見的激活方法為點(diǎn)激活，該方法能夠通過瞬間的高電壓刺激，迫使細(xì)胞膜形成大量微孔，從而極大程度地增大了Ca2+的通透性，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+呈現(xiàn)脈沖式升高［16］。通過控制電刺激參數(shù)，產(chǎn)生正常受精過程Ca2+的節(jié)律性脈沖升高，可模擬出正常受精過程中一系列生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，啟動(dòng)MII期卵母細(xì)胞繼續(xù)成熟分裂，進(jìn)入正常發(fā)育軌道。

乙醇激活法主要的作用通徑為水解細(xì)胞膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)源Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中，提高了胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度，模擬受精過程中Ca2+的變化模式［17］。通常情況下，哺乳動(dòng)物MII期卵母細(xì)胞在含有7%乙醇的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～7 min，就能激活卵母細(xì)胞并形成原核，直至發(fā)育到囊胚。

離子霉素（ionomycin）是一種近年來發(fā)現(xiàn)的高效Ca2+載體，已被廣泛地應(yīng)用于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的激活［18］。離子霉素可以動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)的Ca2+依次觸發(fā)Ca2+內(nèi)流。但離子霉素激活的卵母細(xì)胞無原核形成。

4 核移植的影響因素

4.1 供體與受體細(xì)胞周期的協(xié)調(diào)

供體與受體細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)育同步化是影響核移植成敗的一個(gè)重要因素。一個(gè)處于正常分裂周期的細(xì)胞包括分為間期與分裂期（M期）兩個(gè)階段，間期又分為3期，即G1期、S期與G2期（見圖3）。從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期，稱為G1期，此期主要合成RNA和核糖體為下階段S期的DNA復(fù)制作好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備。S期為DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時(shí)還要合成組蛋白。G2期為DNA合成后期，為M期做準(zhǔn)備。M期則進(jìn)行細(xì)胞分裂。此外，體細(xì)胞還可以暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂進(jìn)入靜止期（G0期）。G0期供體細(xì)胞處于細(xì)胞的靜止期，移入卵細(xì)胞質(zhì)后能夠與卵母細(xì)胞的DNA復(fù)制同步，減少了核移植細(xì)胞發(fā)育過程中染色體畸變的可能性。同時(shí)G0期細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更容易發(fā)生調(diào)整和改變，以適應(yīng)基因表達(dá)程序重編的需要，并且G0期細(xì)胞的染色質(zhì)由于濃縮而使原來的轉(zhuǎn)錄因子脫落，在去濃縮時(shí)卵母細(xì)胞中控制基因表達(dá)的胞質(zhì)信號(hào)分子更容易與供體細(xì)胞DNA結(jié)合。另外，G0期細(xì)胞含有二倍體的染色體，G0期核重構(gòu)胚胎的染色體倍性能維持正常。因此誕生的多種克隆動(dòng)物其供體細(xì)胞都在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使其進(jìn)入G0期。但是，1998年Cibelli等［19］使用牛胎兒非靜止期成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植并獲得了成功，表明讓細(xì)胞處于靜止期并不是必須的。1998年，Wakayama等［20］用處于G0/G1期的鼠卵丘細(xì)胞也獲得了成功。Kasinathan等［21-22］通過研究發(fā)現(xiàn)，G0期細(xì)胞不如G1期作供體效果好。目前，關(guān)于G0期對(duì)供體細(xì)胞核移植的必要性仍不能給予有利證明。

圖3 細(xì)胞分裂周期

在核移植研究中普遍采用去核的MⅡ期卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)，從細(xì)胞周期角度來看，MⅡ期卵母細(xì)胞含有高水平的M期促進(jìn)因子（MPF）。該細(xì)胞因子主要由周期素B（cyclin）和p34cdc2組成的復(fù)合物。MPF作為一個(gè)蛋白激酶，MPF的活性受自身磷酸化/去磷酸化的狀態(tài)所調(diào)控，其含量水平在細(xì)胞周期和成熟的不同階段也會(huì)發(fā)生變化。在所有動(dòng)物中，MPF水平在G2期過渡到M期時(shí)升高，而在后期和末期降低。MPF水平在第二次減數(shù)分裂中期顯著增高，使成熟的卵母細(xì)胞靜止于MⅡ期，在受精或卵細(xì)胞激活時(shí)，MPF活性急劇下降，導(dǎo)致細(xì)胞減數(shù)分裂，第二極體排出。高水平的MPF，可以誘導(dǎo)移入核的核膜破裂和早熟染色體凝集的發(fā)生，從而保證供體核DNA的正確復(fù)制和重編程。Manandhar等［23］通過比較體細(xì)胞分別移入去核的MⅠ和MⅡ期卵細(xì)胞后形成的豬重構(gòu)胚胎在體外的發(fā)育能力，發(fā)現(xiàn)MⅠ期卵細(xì)胞同樣可以作為核移植的受體，這可能與MⅠ期是卵細(xì)胞成熟過程中MPF的高峰期有關(guān)。然而欲使核移植后細(xì)胞正常活動(dòng)，核移植過后必須降低MPF水平，否則染色體損壞或異倍體化率將會(huì)很高［24-25］。協(xié)調(diào)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞的周期對(duì)維持重構(gòu)胚胎的正確染色體倍數(shù)和阻止DNA損傷是必要的。不同周期階段的供體與受體細(xì)胞組合能夠阻止DNA損壞以及不協(xié)調(diào)復(fù)制導(dǎo)致的假原核現(xiàn)象。另外，研究發(fā)現(xiàn)用M期卵細(xì)胞能促進(jìn)供體遺傳物質(zhì)的重編程，因?yàn)楹四て屏?，早期染色體凝聚的出現(xiàn)，將供體染色質(zhì)暴露在與早期發(fā)育有關(guān)的受體細(xì)胞質(zhì)因子之中［26］。

4.2 卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量

卵母細(xì)胞是核供體細(xì)胞重編程的場(chǎng)所，為克隆胚胎發(fā)育提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的來源以及成熟質(zhì)量直接影響到克隆效率的高低。近年來，為提高卵母細(xì)胞與克隆胚胎的質(zhì)量，研究人員進(jìn)行了大量的嘗試。有研究表明，在克隆豬胚胎的培養(yǎng)中添加一定劑量的維生素C可以顯著提高克隆胚的質(zhì)量，一些干細(xì)胞因子（Oct4、Klfl4、Sox2）的mRNA表達(dá)量明顯上升，其表達(dá)量可達(dá)到IVF胚胎水平，使用維他命C處理過的胚胎進(jìn)行胚移后，其產(chǎn)仔率明顯升高［27］。使用CBHA（一種去組蛋白乙酰化抑制劑）處理小鼠的克隆胚胎后，胚胎克隆效率明顯提高，并且還源于克隆胚胎的干細(xì)胞質(zhì)量也明顯提升［28］。

4.3 胚胎移植方法與動(dòng)物后期管理

根據(jù)不同動(dòng)物的特點(diǎn)選擇配套的胚胎移植方法，通常豬、羊選擇腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)方法進(jìn)行移植，移植的部位為子宮和輸卵管；牛、馬選擇非手術(shù)的方式進(jìn)行胚胎移植，移植部位為子宮。妊娠的受體動(dòng)物的后期管理非常重要，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物會(huì)存在很大比例的發(fā)育異常，極有可能導(dǎo)致無故流產(chǎn)、胎兒巨大難產(chǎn)、出生動(dòng)物存活率低等現(xiàn)象。

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Progress in Somatic Cell Nuclear Transfer

WangWei，F(xiàn)u Maozhong，Yi Jun，et al
（Sichuan Animal Science Academy，Chengdu 610066，China）

The somatic cell nuclear transfer（SCNT）has been widely applied in production of transgenic animal due to the high performance and the lowcost.However，cloningbysomatic cell nuclear transfer（SCNT）is still inefficient.This paper summarized some important aspects ofOSM，and alsoanalyzed the factor that related tothe OSM.

somatic cell nuclear transfer；donor cell；receptor cell；embryo

Q813.7

A

2095-3887（2017）02-0044-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.015

2017-01-17

四川省基本科研項(xiàng)目（2015JY0181）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2015BAD03B04-3）；四川省科技支撐項(xiàng)目（2015NZ0020）；四川省育種攻關(guān)項(xiàng)目（2016NYZ0050）；四川省公益類科研院所基本科研項(xiàng)目（SASA2014A05）

王巍（1984-），男，蒙古族，副研究員，博士。

易軍（1971-），男，研究員，本科。研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料加工。