翟葳，馮極靈，席志超，譚紅勝＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

Guttiferone K誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞G0/1期阻滯的作用研究＊

翟葳1，2，馮極靈1，2，席志超1，2，譚紅勝1，2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

目的：本文主要觀察從云南藤黃Garcinia yunnanensis中提取分離得到的多環(huán)多異戊烯基間苯三酚（Polycyclic Polyprenylated Acylphoroglucinols，PPAPs）類化合物Guttiferone K（GUTK）對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖情況的影響。方法：取處于對(duì)數(shù)生長期的人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，給予GUTK。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的情況；采用PI染色的流式分析法、BrdU法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞的周期分布；采用Western Blotting法檢測(cè)Cyclin A、p27和激酶相關(guān)蛋白-2（S-Phase Kinase-Associated Protein 2，SKP2）蛋白水平的變化。結(jié)果：GUTK呈時(shí)間和劑量依賴性地抑制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖；GUTK能夠誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的G0/1期細(xì)胞周期阻滯；GUTK能夠下調(diào)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞Cyclin A和SKP2蛋白的表達(dá)水平并上調(diào)p27蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：從云南藤黃中提取分離得到的化合物GUTK能夠通過誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞G0/1期細(xì)胞阻滯來抑制細(xì)胞的增殖，具有潛在的抗腫瘤作用。

Guttiferone K細(xì)胞周期前列腺癌抗腫瘤作用

前列腺癌作為當(dāng)今全球男性癌癥中發(fā)病率最高的癌癥[1,2]，因其發(fā)病率、死亡率高嚴(yán)重影響男性健康，亟需開發(fā)有效藥物來治療和控制病情。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GUTK具有潛在的抑制前列腺癌復(fù)發(fā)的作用[3,4]，但對(duì)其是否有治療作用尚不清楚。本文擬在已有研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究GUTK對(duì)于前列腺癌的藥效及作用機(jī)制。人前列腺癌細(xì)胞株——LNCaP，是由Horoszewicz等[5]從前列腺癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移灶中分離得到的，它保留了早期前列腺癌對(duì)雄激素依賴的特征。本研究選用人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，旨在重點(diǎn)關(guān)注GUTK對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響，并對(duì)其作用機(jī)制做初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人前列腺癌LNCaP細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。培養(yǎng)基為RPMI1640（美國GIBCO公司）。

1.1.2 藥品與試劑

Guttiferone K（GUTK）為本課題組于云南藤黃中提取分離得到的化合物，純度為98%；MTT（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide）購自江蘇碧云天生物公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma-Aldrich公司（批號(hào)：D4540）；瓊脂糖和石蠟液購自美國Thermo公司（批號(hào)：111860、1210056）；BrdU購自德國BoehringerMannheim Biochemica公司；碘化丙啶（PI），蘇木素染料，甘油明膠封片液，RNase A，免疫染色封閉液和DAB顯色液購自江蘇碧云天生物公司；Cyclin A（ab185619）、SKP2（ab183039）、α-Tubulin（ab7291）和p27（ab32034）抗體均購自美國Abcam公司（批號(hào)：2011、GR97918-4、1912、0912）。

1.2 儀器

實(shí)驗(yàn)儀器有：細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Themo公司，型號(hào)：3541），光學(xué)倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)：CX21），離心機(jī)（美國Eppendorf公司，型號(hào)：5811），全波長酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司，型號(hào)：Synergy HTX），流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號(hào)：FACSCalibur）。

1.3 方法

1.3.1 應(yīng)用MTT法檢測(cè)GUTK對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)期人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，以4×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入2.5-30.0μM濃度的GUTK，對(duì)照組加入最高濃度所對(duì)應(yīng)的DMSO（濃度＜0.5%），每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5mg·mL-1，溶于1%的PBS溶液）10μL，常規(guī)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入二甲亞砜150μL，振蕩。酶標(biāo)儀以波長570 nm檢測(cè)每孔吸光度，以加入GUTK的濃度為橫坐標(biāo)、以存活率（存活率=吸光度GUTK值/吸光度DMSO值×100）為縱坐標(biāo)，繪制24、48、72 h人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生長曲線，計(jì)算IC50和IC75。

1.3.2 應(yīng)用PI染色的流式分析法檢測(cè)GUTK對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

取對(duì)數(shù)期人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，接種于培養(yǎng)皿中。24 h后分別加入6μM GUTK、12μM GUTK和DMSO處理72 h；收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，以體積PBS∶體積無水乙醇為3∶7的比例逐滴加入預(yù)冷的無水乙醇，固定細(xì)胞；用500μL含濃度為20μg·mL-1的PI和100μg·mL-1的RNase A的PBS重懸細(xì)胞，避光孵育，PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件（8.1.1版本）分析GUTK對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。

1.3.3 應(yīng)用BrdU法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)GUTK對(duì)誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞G0/1期細(xì)胞阻滯的影響

取對(duì)數(shù)期人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化接種于6孔板內(nèi)，并同時(shí)分別給予6μM GUTK、12μM GUTK和DMSO處理細(xì)胞，每組平行兩個(gè)復(fù)孔，72 h后加入0.03μg·mL-1BrdU孵育8 h，收集細(xì)胞。以1mL 10%中性福爾馬林制細(xì)胞懸液，固定細(xì)胞；將1%瓊脂糖包裹的細(xì)胞沉淀，進(jìn)行石蠟包埋，切片，脫蠟。孵育一抗室溫下1 h或者4℃過夜，TBS清洗，孵育二抗30min，TBS清洗，浸泡。按ABC法檢測(cè)，蘇木素襯染，脫水，封片。顯微鏡40×物鏡下觀察GUTK對(duì)誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的G0/1期細(xì)胞阻滯的影響。

1.3.4 Western Blotting檢測(cè)SKP2、Cyclin A和p27蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)期人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)24 h后，分別加入6μM GUTK、12μMGUTK和DMSO處理72 h，收集細(xì)胞。使用RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF按照100∶1∶1∶1混合均勻的混合液裂解細(xì)胞；BCA法測(cè)定蛋白濃度；30μg蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合；樣品上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗及二抗；于膜上滴加ECL曝光液，置于成像儀內(nèi)曝光、攝片。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel2013軟件及SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析；數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。用Students’t-test方法進(jìn)行兩組間的比較，P＜0.05或P＜0.01為差異有顯著或極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GUTK抑制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖

采用MTT法檢測(cè)不同濃度的GUTK在體外分別作用LNCaP細(xì)胞24-72 h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響，繪制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生長曲線。結(jié)果如圖1所示，GUTK呈時(shí)間和劑量依賴性地抑制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖。計(jì)算72 h的IC50、IC75分別為6μM和12μM，并以此濃度開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 GUTK誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞發(fā)生G0/1期細(xì)胞阻滯

為驗(yàn)證GUTK通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程從而發(fā)揮抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖的作用，采用PI染色的流式細(xì)胞術(shù)觀察GUTK處理對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果如圖2所示。分別用6μM GUTK、12μM GUTK和DMSO處理LNCaP細(xì)胞72 h，發(fā)現(xiàn)經(jīng)GUTK處理的實(shí)驗(yàn)組處在S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)較DMSO組明顯降低（圖2A）。分別對(duì)處在不同時(shí)期的細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，DMSO組與6、12μM GUTK組處在G0/1期的細(xì)胞比例分別為62%、77%和81%，與DMSO組對(duì)比具有顯著性差異，S期比例分別為20%、10%和12%，G2/M期比例分別為17%、11%和7%（圖2B）。以上結(jié)果表明，GUTK可以呈劑量依賴性地增加處于G0/1期的細(xì)胞，阻止細(xì)胞周期由G0/1期進(jìn)入S期的進(jìn)程，即GUTK有明顯誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞G0/1期阻滯的作用。

圖1 GUTK抑制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖的情況（MTT法）

圖2 GUTK對(duì)LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的影響（PI流式分析法）

2.3 BrdU法驗(yàn)證GUTK抑制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞由G0/1期進(jìn)入S期

BrdU可以在DNA合成時(shí)競(jìng)爭性替代堿基“T”，從而插入染色體，并通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)分析。為了驗(yàn)證GUTK具有誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞G0/1期阻滯的作用，本文選擇BrdU法檢測(cè)經(jīng)GUTK作用后，人前列腺癌LNCaP細(xì)胞處于S期的比例。結(jié)果如圖3所示，與加入DMSO的對(duì)照組相比，加入6μM GUTK和12μM GUTK的LNCaP細(xì)胞處在S期的比例明顯減少，且加入GUTK的劑量越高，S期的細(xì)胞比例越低。說明GUTK可以劑量依賴性地阻礙人前列腺LNCaP細(xì)胞進(jìn)入S期。

2.4 GUTK可下調(diào)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞中Cyclin A和SKP2蛋白的表達(dá)水平，并上調(diào)p27蛋白的表達(dá)水平

Cyclin A為S期的特征性細(xì)胞周期蛋白，存在于細(xì)胞核中，其合成在細(xì)胞周期由G1進(jìn)入S期時(shí)有明顯的增加，主要作用與DNA的復(fù)制有關(guān)[6]。S期細(xì)胞SKP2屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)的組成部分，通過特異性招募底物蛋白進(jìn)行泛素化降解而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。SKP2能通過調(diào)控抑癌基因p27的表達(dá)從而阻滯細(xì)胞周期于G1期[7]。p27是一種抑癌基因，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，主要通過阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤增殖的作用[8]。結(jié)果如圖4所示，與DMSO組相比，加入6μM和12μM GUTK處理72 h的樣品中，SKP2、Cyclin A蛋白的表達(dá)量顯著下降，而p27蛋白的表達(dá)量明顯升高。以上結(jié)果表明，GUTK通過下調(diào)SKP2和Cyclin A蛋白的表達(dá)量和上調(diào)p27蛋白的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞的G0/1期阻滯的作用。

圖3 GUTK對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞進(jìn)入S期的影響（BrdU法）

3 討論

GUTK是從中國藤黃屬植物云南藤黃中提取分離得到的小分子化合物。本課題組前期已發(fā)表了GUTK抑制前列腺癌復(fù)發(fā)的研究[3,4]。GUTK能夠在靜止期前列腺癌細(xì)胞激活過程中抑制DNA的合成，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，延緩癌癥復(fù)發(fā)的進(jìn)程。同時(shí)，GUTK能夠通過增加FBXW7蛋白的穩(wěn)定性來促進(jìn)c-MYC在泛素-蛋白酶體途徑的降解，從而下調(diào)c-MYC蛋白的表達(dá)，降低GUTK抑制靜止期前列腺癌細(xì)胞重新激活的能力。此外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，GUTK還能夠抑制靜止期前列腺癌細(xì)胞PC-3裸鼠皮下移植瘤的生長。綜上，GUTK具有潛在的抑制前列腺癌復(fù)發(fā)的作用。

本文進(jìn)一步考察了GUTK對(duì)前列腺癌的治療作用。本研究首先采用MTT法確定了GUTK抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖的作用，再以PI染色的流式分析法、BrdU法及免疫細(xì)胞化學(xué)法相互佐證確定GUTK對(duì)于細(xì)胞周期阻滯的作用，后用Western Blotting法檢測(cè)周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，初步探究了GUTK的作用機(jī)理。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果從細(xì)胞水平和蛋白水平驗(yàn)證了GUTK能夠誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細(xì)胞發(fā)生G0/1期阻滯，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用。

目前本研究主要考察了GUTK抑制人前列腺癌的體外活性，而對(duì)GUTK在體內(nèi)是否可以有效的抑制前列腺癌還需要進(jìn)行后續(xù)的研究。課題組在前期研究中已經(jīng)對(duì)GUTK的體內(nèi)抗腫瘤活性和毒性進(jìn)行過一定的評(píng)價(jià)，可為本文的后續(xù)研究提供參考。根據(jù)已報(bào)道的研究結(jié)果，在人靜止期前列腺癌PC-3細(xì)胞形成的前列腺癌復(fù)發(fā)模型中[3]，預(yù)防性給予10mg·kg-1的GUTK可明顯抑制前列腺癌的復(fù)發(fā)，而不造成明顯毒性。該研究中GUTK體外所用濃度為13μM，與本文所用體外濃度相近。根據(jù)以上GUTK體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，10mg·kg-1劑量的GUTK可能在安全無毒的情況下發(fā)揮其抗腫瘤作用。

目前針對(duì)前列腺癌的不同階段，臨床已有多種治療方案，但是每種治療方案均存在弊端，需要開發(fā)高效低毒的新型藥物。天然產(chǎn)物是先導(dǎo)化合物研發(fā)的重要來源之一，具有結(jié)構(gòu)新穎、低毒、高活性的特點(diǎn)。GUTK源自可食用的中國藤黃屬植物云南藤黃的果實(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)GUTK可通過下調(diào)SKP2和Cyclin A蛋白的表達(dá)水平以及上調(diào)p27蛋白的表達(dá)水平誘導(dǎo)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞發(fā)生G0/1期細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖。結(jié)合前期研究和本文的結(jié)論，GUTK可能發(fā)揮預(yù)防和治療前列腺癌的雙重作用，有望開發(fā)成為前列腺癌的新型治療藥物。本研究的發(fā)現(xiàn)還將為GUTK作為安全低毒的細(xì)胞周期抑制劑與化療藥物聯(lián)用治療前列腺癌提供新的思路。后續(xù)研究將在本文結(jié)論的基礎(chǔ)上，對(duì)GUTK抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的體內(nèi)藥效研究及作用機(jī)制做深入的研究，同時(shí)考慮將GUTK與化療藥物聯(lián)用，以尋求緩解耐藥性、增加化療藥效的高效前列腺癌治療方案。

圖4 GUTK作用后人前列腺癌LNCaP細(xì)胞中Cyclin A、SKP2和p27蛋白的表達(dá)水平

1韓蘇軍,張思維,陳萬青,等.中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析.臨床腫瘤學(xué)雜志,2013,18(4)：330-334.

2 Siegel R L,Miller K D,Jemal A.Cancer Statistics,2017.CA:ACancer JournalforClinicians,2017,67：7-30.

3 Xi Z,Yao M,Li Y,et al.Guttiferone K impedes cell cycle re-entry of quiescent prostate cancer cell via stabilization of FBXW 7 and subsequentc-MYC degradation.CellDeath Dis,2016,7(6)：e2252.

4席志超,姚睦,李洋,等.GuttiferoneK抑制靜止期前列腺癌細(xì)胞重新激活的作用研究.世界中醫(yī)藥,2016,11(7)：1171-1175.

5林艷端,申鍔,胡兵.三種常見的前列腺癌細(xì)胞系LNCap、PC3和DU145的生物學(xué)特性.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(11)：4980-4982.

6 Chen ZH,Zhao R J,LiRH,etal.Bioluminescence imagingofDNA synthetic phaseof cellcycle in livinganimals.PLoSOne,2013,8：e53291.

7 Lu H,Gan M,Cao X,etal.RNAi-mediated silencing of the Skp-2 gene causes inhibition of growth and induction of apoptosis in human renal carcinoma cells.Int JClin Exp Pathol,2014,7：3845-3852.

8羅昆侖.p27與細(xì)胞周期調(diào)控.國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè)),1998,25(5)：262-265.

Effectsof Guttiferone K on Inducing G0/1Arrestof Prostate Cancer LNCaPCells

ZhaiWei1,2,Feng Jiling1,2,XiZhichao1,2,Tan Hongsheng1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering Research CenterofShanghaiCollegesforTCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China)

This study aimed at investigating the effects of Guttiferone K(GUTK),a polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols(PPAPs)compound isolated from Garcinia yunnanensis,on the cell proliferation of human prostatecancer LNCaP cell line.Human prostate cancer LNCaP cells in the period of logarithmic phasewere treated with GUTK. MTT assay was used to detect cell proliferation.Flow cytometry of propidium iodide(PI)staining,BrdU assay and immunocytochemistrywere adopted to analyze the cell cycle phase distribution.Protein levelsofCyclin A,p27 and SKP2 were detected by western blotting.The results showed that GUTK inhibited the proliferation and induced G0/1arrest of LNCaP cells in a time and dose dependentmanner.The protein levels of Cyclin A and SKP2 were decreased,while p27 was increased by GUTK in human prostate cancer LNCaP cells.Itwas concluded thatGUTK,a compound isolated from G.yunnanensis,presented the effect of inhibiting the cell proliferation by inducing G0/1arrest of human prostate cancer LNCaPcells,with potentialanti-prostate canceraction.

Guttiferone K,cell cycle,prostate cancer,anti-cancereffect

10.11842/wst.2017.02.008

R28

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2017-02-20

修回日期：2017-02-20

＊中國博士后科學(xué)基金會(huì)第60批中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016M601641）：藤黃屬PPAPs類化合物抑制前列腺癌復(fù)發(fā)的活性研究，負(fù)責(zé)人：席志超。

＊＊通訊作者：譚紅勝，副研究員，主要研究方向：中藥活性成分研究及中藥新藥研發(fā)。