賀曉輝，肖志新，宋玉川，胡志明，王 杰，李義強(qiáng)，王鳳龍

（1.云南省香料煙有限責(zé)任公司，云南 德宏州 678400；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所，山東 青島 266101；3.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000）

云南省德宏州煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性

賀曉輝1，肖志新3，宋玉川1，胡志明3，王 杰2，李義強(qiáng)2，王鳳龍2

（1.云南省香料煙有限責(zé)任公司，云南 德宏州 678400；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所，山東 青島 266101；3.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000）

為明確新開發(fā)煙葉生產(chǎn)區(qū)云南省德宏州煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性現(xiàn)狀，從德宏州13個(gè)縣市采集68株煙草黑脛病菌株，采用菌絲生長速率法測(cè)定了煙草黑脛病菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性和抗藥水平。結(jié)果表明，烯酰嗎啉抑制煙草黑脛病菌菌絲生長的EC50范圍為0.462 8~2.575 2 μg/mL，平均EC50為1.388 1 μg/mL，屬于中抗水平。統(tǒng)計(jì)分析表明，煙草黑脛病菌68個(gè)菌株菌絲生長對(duì)烯酰嗎啉的敏感性符合正態(tài)分布，最不敏感菌株的EC50值為最敏感菌株的5.56倍。烯酰嗎啉對(duì)德宏州煙草黑脛病仍有較高活性，但應(yīng)與其他殺菌劑進(jìn)行合理的輪換使用。

煙草黑脛病菌；烯酰嗎啉；抗藥性水平

煙草黑脛病是由煙草疫霉（Phytophthora parasitica var．nicotianae(Breda de Hean)Tucker）引起的一種破壞性極強(qiáng)，危害嚴(yán)重的真菌性土傳病害。該病在我國各煙草產(chǎn)區(qū)大量發(fā)生，是僅次于煙草病毒病的病害，嚴(yán)重影響了煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。因德宏州潮濕、多雨條件較適宜煙草黑脛病菌的生長繁殖，再加上主栽品種為品質(zhì)較好的易感病品種“紅花大金元”，致使近期德宏州煙葉生產(chǎn)區(qū)煙草黑脛病發(fā)病嚴(yán)重，平均發(fā)病率為20%～40%，嚴(yán)重田塊發(fā)病率高達(dá)70%～80%，甚至造成絕產(chǎn)，每年給煙農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。目前，防治煙草黑脛病主要通過采用抗病品種、栽培防治、化學(xué)防治等措施，其中化學(xué)防治是最普遍且實(shí)用的方法，但是病菌極易對(duì)常規(guī)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性[6]。因此，為了有效地對(duì)黑脛病進(jìn)行防治，急需篩選出一批安全、高效的殺菌劑進(jìn)行合理的替代或輪換。

烯酰嗎啉是一種防治疫霉屬高效內(nèi)吸性羧酸氨基類殺菌劑，對(duì)疫霉屬細(xì)胞壁具有獨(dú)特的作用方式[7]。其防治范圍為卵菌綱病原菌引起的葡萄、黃瓜、白菜霜霉病、番茄、馬鈴薯、辣椒疫病、大豆疫霉根腐病、煙草黑脛病等。近年來，我國大部分煙區(qū)已開始使用烯酰嗎啉類殺菌劑對(duì)該病害進(jìn)行防治[8-9]。因此研究煙草黑脛病菌田間菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性及其抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)預(yù)測(cè)病原菌抗藥群體的發(fā)展動(dòng)態(tài)和制定抗性治理策略具有重要的意義。本研究首次分析了新開發(fā)煙葉生產(chǎn)區(qū)云南省德宏州煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑烯酰嗎啉的敏感性，旨在建立煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性基線，并對(duì)德宏州煙草黑脛病菌的抗藥性水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以期為田間抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估和抗性治理提供理論依據(jù)，指導(dǎo)煙草安全生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 煙草黑脛病菌的分離

2013從云南省德宏州種植烤煙品種“紅花大金元”、KRK26、云煙87的10個(gè)縣市和種植香料煙的3個(gè)縣市不同煙區(qū)采集具有黑脛病典型癥狀的病株，于加有抗生素的選擇性黑麥培養(yǎng)基（RSA）上分離純化所得，總共得到68個(gè)菌株。所有煙草黑脛病菌菌株黑暗保存于10oC菌種保存柜。經(jīng)分子鑒定菌株生理小種種類和具體分布見表1。

1.2 供試藥劑

供試的95%烯酰嗎啉原藥用分析純丙酮溶解，配制成10 μg/mL貯液，保存于4oC冰箱中備用。

1.3 烯酰嗎啉敏感基線的建立

分別對(duì)不同煙區(qū)68個(gè)菌株用含藥平板法進(jìn)行烯酰嗎啉敏感性測(cè)定。供試菌株在黑麥培養(yǎng)基上25oC黑暗培養(yǎng)5~7 d后，分別配制含烯酰嗎啉0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/mL的8個(gè)不同濃度梯度的V8汁選擇性培養(yǎng)基平板。

用直徑為5 mm的打孔器在相同圓周的菌落邊緣上切取菌餅，將菌餅正面朝下，分別接種到含烯酰嗎啉系列濃度梯度的V8培養(yǎng)基平板上（直徑9 cm），每處理3次重復(fù)，置于25oC恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑。根據(jù)菌落直徑計(jì)算出生長量，計(jì)算烯酰嗎啉各濃度梯度對(duì)黑脛病菌菌絲生長抑制的百分率。

通過SPSS13.0軟件，將藥劑濃度轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)（x），抑制率轉(zhuǎn)化成機(jī)率值（y），建立其毒力回歸方程y=bx+a，根據(jù)x與y的線性關(guān)系計(jì)算出相關(guān)系數(shù)（R）、烯酰嗎啉對(duì)黑脛病菌各菌株抑制中濃度EC50值（菌絲生長50%的有效質(zhì)量濃度），并進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。

根據(jù)王文橋等[10]的方法進(jìn)行煙草黑脛病菌抗性水平劃分，將菌株分為抗性菌株（EC50＞10 μg/mL）、中間型菌株（0.1 μg/mL≤EC50≤10 μg/mL）和敏感菌株（EC50＜0.1 μg/mL）。

2 結(jié)果

2.1 煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉敏感性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)描述的煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性基線，選擇含藥0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的5個(gè)濃度梯度，測(cè)定2013年從德宏州分離純化的煙草黑脛病菌菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性。從表2可以看出，從德宏州13個(gè)縣市分離獲得的煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的EC50值在0.462 8~2.575 2 μg/mL，平均EC50為1.388 1 μg/mL，表明所測(cè)菌株屬于中間型菌株。其中，最敏感菌株來自梁河芒東LD4，EC50值為0.462 8 μg/mL，而抗藥性水平最高的菌株為盈江弄璋的YN3，其EC50值是2.575 2 μg/mL，為菌株LD4的5.56倍。在所測(cè)定的68個(gè)菌株中，值得注意的是芒市孟戛、遮放，隴川城子、戶撒和盈江弄璋生產(chǎn)區(qū)分離到的煙草黑脛病菌，其EC50值相對(duì)其他區(qū)域稍高，在今后黑脛病防控措施中應(yīng)采取合理的殺菌劑輪換施用，避免長期使用靶標(biāo)單一的殺菌劑后因高選擇壓而導(dǎo)致產(chǎn)生高抗藥性菌株。

2.2 煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉敏感性分布

在煙草黑脛病菌對(duì)藥劑的敏感性變化范圍內(nèi)，將EC50等分為10個(gè)階段，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)階段菌株的個(gè)數(shù)和頻率，然后以每個(gè)階段EC50的中值為橫坐標(biāo)，頻率為縱坐標(biāo)，作出頻率分布圖（圖1），結(jié)果表明煙草黑脛病菌絲對(duì)烯酰嗎啉的敏感性呈單峰曲線，經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，得到Z=0.120 1，P=0.695，表現(xiàn)較好的連續(xù)性，表明德宏州13個(gè)縣市的68個(gè)煙草黑脛病菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性的頻率分布符合正態(tài)分布。

3 討論

烯酰嗎啉對(duì)疫霉卵菌綱的作用特點(diǎn)是首先影響細(xì)胞壁分子結(jié)構(gòu)的重新排列，然后干擾病原菌細(xì)胞壁聚合體的組裝，從而干擾細(xì)胞壁的形成和促使孢子囊壁的分解，使病原菌出現(xiàn)自動(dòng)死亡，對(duì)病菌作用位點(diǎn)單一。病菌易發(fā)生突變，產(chǎn)生抗藥性[11]。鑒于烯酰嗎啉在防治疫霉過程中易產(chǎn)生抗藥性菌株，國內(nèi)外陸續(xù)開展了烯酰嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌的敏感性、抗性水平、生物活性及防治效果方面的相關(guān)研究[12-16]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)德宏州13個(gè)縣市的紅花大金元、KRK26、云煙87和香料煙煙區(qū)分離獲得的煙草黑脛病菌的敏感性、抗藥性水平進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示德宏州68個(gè)煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的EC50值在0.462 8~2.575 2 μg/mL之間，平均為1.388 1 μg/mL，抗藥性水平與戰(zhàn)徊旭等[12]2010年測(cè)定的瀘州田間24個(gè)煙草黑脛病菌菌株對(duì)烯酰嗎啉的EC50（0.110～1.615 μg/mL）值相比，抗藥性水平有所增加；與大理的0.587 8~2.525 4 μg/mL相似[13]，但明顯低于蘇凱等[14]測(cè)定的貴州省47個(gè)煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的的抗藥性水平（EC50范圍為0.792 6～4.232 7 μg/mL），由此可以判定烯酰嗎啉對(duì)德宏州生產(chǎn)區(qū)煙草黑脛病菌仍有較好的防控效果，而且烯酰嗎啉與甲霜靈沒有交互抗性。朱桂寧等[15]報(bào)道50%烯酰嗎啉可濕性粉劑對(duì)煙草黑脛病的防效顯著優(yōu)于常用藥劑68%精甲霜靈·代森錳鋅水分散粒劑。因此，烯酰嗎啉可成為甲霜靈等苯酰氨類殺菌劑的理想替換藥劑用于云南德宏州煙草黑脛病的防治。目前我國已經(jīng)檢測(cè)到煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性菌株，證實(shí)了烯酰嗎啉存在抗性風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此應(yīng)注意在煙草生產(chǎn)中要合理地進(jìn)行有效藥劑的輪換，不要長期單一施用烯酰嗎啉類殺菌劑，以免對(duì)病原菌造成較大的選擇壓力，增加抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。

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Sensitivity of Phytophthora deliciosa to Deacylmorpholine in Dehong Prefecture,Yunnan Province

HE Xiao-hui1,XIAO Zhi-xin3,SONG Yu-chuan1,Hu Zhi-ming3, WANG Jie2,LI Yi-qiang2,WANG Feng-long2

(1.Yunnan Fragrance Tobacco Co.,Ltd.,Dehong,Yunnan 678400,China;2.Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao,Shandong 266101,China;3.Baoshan Tobacco Co., Yunnan Province,Baoshan,Yunnan 678000,China)

In order to clarify status quo of the sensitivity of tobacco black shank fungi to enoylmorpholine in the newly developed tobacco production area in Dehong Prefecture,Yunnan Province,the susceptibility was studied.68 strains of tobacco black shank were collected from 13 counties and cities of Dehong.The sensitivity and resistance level of the tobacco black shank strains to the alkenoylmorpholine were determined by the rate method.The results showed that the EC50of mycelia growth was 0.462 8~2.575 2 μg/mL,and the average EC50was 1.388 1 μg/mL,which belonged to the middle resistance level.The results also showed that the sensitivity of 68 mycelial growth to myoylmorpholine was in accordance with the normal distribution.EC50of the least sensitive strains were 5.56 times of the most sensitive ones.Deacylmorpholine was still highly active to tobacco black shank in Dehong,but should be used with other fungicides for reasonable rotation.

tobacco black shank pathogen;enolomorphine;drug resistance level

S435.72

A

2095-3704（2017）01-0008-06

10.3969/j.issn.2095-3704.2017.01.002

賀曉輝,肖志新,宋玉川,等.云南省德宏州煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性[J].生物災(zāi)害科學(xué),2017,40(1):8-13.

2017-01-21

云南省煙草公司科技支撐項(xiàng)目（2014YN37）

賀曉輝，農(nóng)藝師，碩士，主要從事晾曬煙生產(chǎn)技術(shù)研究及推廣工作，75350507@qq.com。