高小麗

(重慶化工職業(yè)學(xué)院，重慶 401228)

細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

高小麗

(重慶化工職業(yè)學(xué)院，重慶 401228)

隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)，本文對(duì)目前常見(jiàn)細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和方法的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用作一個(gè)較全面的綜述。

細(xì)胞；檢測(cè)技術(shù)；應(yīng)用

細(xì)胞的研究已成為生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容，因此，與此相應(yīng)的細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越受到人們重視，本文將對(duì)目前常見(jiàn)的幾種細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和方法做一概述。

1 顯微鏡技術(shù)

20世紀(jì)六十年代以來(lái)，顯微技術(shù)逐漸成為了研究細(xì)胞一個(gè)主要工具，它實(shí)現(xiàn)了從亞顯微層次甚至分子層次去研究細(xì)胞的聚集、排斥以及黏附行為，細(xì)胞的連接阻斷，細(xì)胞的免疫識(shí)別，細(xì)胞的融合以及細(xì)胞與其他物質(zhì)(如酶作用物、藥物、化合物、小分子等)的相互作用等等。接下來(lái)，本文將重點(diǎn)介紹幾種熒光和電子顯微鏡技術(shù)及一些化學(xué)、物理細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)。

1.1 熒光顯微檢測(cè)技術(shù)

熒光顯微技術(shù)是利用紫外線照射物質(zhì)，使之發(fā)出熒光，然后再在顯微鏡下觀察物體形狀或位置的一種方法，它既可以檢測(cè)細(xì)胞中某些本身可以發(fā)熒光的物質(zhì)，也可以檢測(cè)本身不能發(fā)熒光但用熒光染料或熒光抗體染色后，可以發(fā)熒光的物質(zhì)。如李勤[1]等人利用熒光顯微鏡對(duì)As2O3誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞核凋亡過(guò)程中的鈣振蕩進(jìn)行研究。

后來(lái)，熒光蛋白新型標(biāo)記物的出現(xiàn)了，熒光顯微鏡得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，一系列新型的熒光顯微檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如熒光斑點(diǎn)顯微鏡(FSM) ，熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)以及基于熒光壽命測(cè)量的熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡(FRETM)和全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)等，這些技術(shù)廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究、蛋白在活細(xì)胞內(nèi)功能定位及遷移變化、基因治療、融合標(biāo)記，病原菌侵入活細(xì)胞的分子過(guò)程，單分子檢測(cè)(如細(xì)胞內(nèi)受體)，胞外分泌或細(xì)胞內(nèi)吞作用的成像，細(xì)胞與基層的相互作用的形貌，進(jìn)行蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究，膜離子通道研究以及相關(guān)膜的光敏劑研究，為實(shí)現(xiàn)在分子水平上進(jìn)行細(xì)胞研究作出了巨大的貢獻(xiàn)。

熒光顯微檢測(cè)技術(shù)作為生物物理、生物化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究的重要工具已有很大的進(jìn)展，在與先進(jìn)方法融合后，減少了背景熒光，增加了信號(hào)分辨率，解決了由于非均勻熒光標(biāo)記所造成的不能進(jìn)行的熒光結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的難題，但仍然由于紫外線光源殺傷力問(wèn)題，在對(duì)極微弱熒光的使用時(shí)間方面受到限制。

1.2 激光共聚焦掃描顯微鏡

激光共聚焦掃描顯微鏡[2](LCSM)是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上，利用激光掃描和共聚焦光路獲得樣品的顯微圖像，可對(duì)活細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。目前，激光共聚焦掃描顯微鏡已在形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生物化學(xué)、植物學(xué)、食品學(xué)、病理學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子和pH值進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，可進(jìn)行細(xì)胞間通訊研究和長(zhǎng)時(shí)程觀察細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)，可進(jìn)行組織和細(xì)胞的定量熒光和物理化學(xué)測(cè)定等[3-5]。

激光掃描共聚焦顯微鏡是一項(xiàng)全新的實(shí)驗(yàn)手段和強(qiáng)有力的研究工具，較傳統(tǒng)顯微鏡，有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)，如圖像高反差、高清晰度、定位準(zhǔn)確，具有三維空間分辨能力，能夠同時(shí)獲得多重?zé)晒夂凸忡R圖像，定量測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度、面積、距離等指標(biāo)。近年出現(xiàn)的視頻型共聚焦激光顯微鏡、4Pi共聚焦激光顯微鏡以及多光子共聚焦激光顯微鏡[6]，它們與傳統(tǒng)LCSM比較，更能解決生物組織中深層物質(zhì)的層析成像問(wèn)題，能進(jìn)一步減少熒光背景的干擾，可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的觀察。激光共聚焦顯微鏡已經(jīng)成為亞細(xì)胞層次研究細(xì)胞相互作用的強(qiáng)有力研究工具之一。

1.3 電子顯微技術(shù)

電子顯微鏡是人類迄今為止進(jìn)行細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)觀察中最用力的工具。在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清小于0.2nm的顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡能看清這些結(jié)構(gòu)。它是用高速電子束代替了照明光線，當(dāng)電子束照射樣品時(shí)，由于樣品不同部位對(duì)入射電子具有不同散射度，而形成不同的電子密度的高度放大圖像，最后顯示在熒光屏上或記錄在照相感光膠片上，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)，目前電子顯微鏡的分辨率最高可達(dá)0.08 nm，實(shí)現(xiàn)了原子尺度上觀察物質(zhì)結(jié)構(gòu)的理想。

目前透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)[7]以及80年代以后出現(xiàn)的掃面透射電子顯微鏡在生物學(xué)領(lǐng)域通常是被用于研究細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)微、超細(xì)微結(jié)構(gòu)，提供立體的、原子級(jí)、分子級(jí)、單細(xì)胞級(jí)分辨率的圖像和表面拓?fù)湫畔?，以及形態(tài)分析、毒理分析、藥物作用靶點(diǎn)分析和細(xì)胞微結(jié)構(gòu)分析等重要的有用信息[8]。蔣爭(zhēng)凡等人[9]在透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察到經(jīng)細(xì)胞色素C誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞核的凋亡形態(tài)-染色質(zhì)的凝集及趨邊化。

電子顯微鏡的分辨率雖然比起光學(xué)顯微鏡有了顯著的提高，但電子顯微鏡必須在真空的條件下進(jìn)行觀察，對(duì)生物大分子還須進(jìn)行梯度脫水、染色、臨界點(diǎn)干燥、噴涂導(dǎo)體物質(zhì)等前處理工作，故無(wú)法實(shí)現(xiàn)在接近天然條件和生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)地、原位地、現(xiàn)場(chǎng)地研究生物樣品的單原子、單分子和單細(xì)胞成像。

1.4 掃描探針顯微鏡技術(shù)

掃描探針顯微技術(shù)[10]是用來(lái)探索表面性質(zhì)的儀器家族，其測(cè)量的特征尺寸可以從原子間距到100μm之間變化，至1986以后，相繼出現(xiàn)了很多新型掃描探針顯微鏡，主要有原子力顯微鏡(/AFM) 光子掃描隧道顯微鏡(STP),掃描離子電導(dǎo)顯微鏡(STCM)等,以原子力顯微鏡(AFM)為代表的SFM，它的工作原理是利用一個(gè)對(duì)力非常敏感的微量臂和探針，與樣品表面接觸，產(chǎn)生極其微弱的作用力，使微量臂變形，通過(guò)捕捉這個(gè)形變信號(hào)，來(lái)而獲得物質(zhì)的表面形貌結(jié)構(gòu)信息的一種方法。AFM因其納米級(jí)的空間分辨率、超高靈敏度和免標(biāo)記以及可在溶液下工作等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)， AFM成為細(xì)胞生物學(xué)的重要研究手段，過(guò)去的數(shù)十年中，研究人員利用AFM在細(xì)胞超微形貌成像和機(jī)械特性測(cè)量方面開(kāi)展了廣泛的應(yīng)用研究，可以對(duì)活體細(xì)胞、細(xì)菌、細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)過(guò)程，細(xì)胞膜的精細(xì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行觀察研究[11]。

2 常用的生物學(xué)方法

2.1 MTT法

MTT-四甲基偶氮唑鹽比色法，是90年代發(fā)展起來(lái)的一種測(cè)定細(xì)胞相對(duì)活力和細(xì)胞相對(duì)數(shù)的生物學(xué)方法，其原理是細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶可以使外援性的MTT還原為難溶性FTT甲，一種藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉積在細(xì)胞中，而死亡的細(xì)胞無(wú)此功能，經(jīng)酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)以570 nm比色，測(cè)定各孔的吸光度值A(chǔ)，它在一定程度上反映了細(xì)胞的生存能力，并可以檢測(cè)出OD值與細(xì)胞增值數(shù)目呈直線關(guān)系。這種方法重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行，已被研究者們作為一種輔助方法廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞、藥物、大分子甚至物理輻射等物質(zhì)與細(xì)胞相互作用后的細(xì)胞存活率和細(xì)胞增值情況。但如要進(jìn)行驗(yàn)證或深入研究還需要輔助其他的方法。

2.2 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)[12]是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)，在液流中，處理過(guò)的細(xì)胞逐個(gè)通過(guò)聚集的光源，進(jìn)而快速測(cè)量這些細(xì)胞的光散射、熒光和光吸收等信號(hào)而達(dá)到測(cè)定細(xì)胞的化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)和生物學(xué)特性的目的。它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。陳陽(yáng)等人[13]以羅丹明123作為熒光指示劑，利用耐藥HR-20活細(xì)胞篩選逆轉(zhuǎn)耐藥性的藥物, 建立了一種精確度較高、穩(wěn)定性較好、有效的高通量藥物篩選方法。

3 其他方法

3.1 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳(CE)是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離檢測(cè)技術(shù)，因其樣品用量少、分析速度快的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞內(nèi)多種組分的分離和測(cè)定。Ewing，Jorgenson 和Sweedler 研究組開(kāi)創(chuàng)性地將毛細(xì)管電泳用于非哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞分析。Frederic 等用CE-LIF測(cè)量鼠腦中兒茶酚胺和氨基酸的含量。

3.2 細(xì)胞傳感器法

細(xì)胞傳感器技術(shù)[32]利用活細(xì)胞作為研究對(duì)象，使之與電極或其他信號(hào)元件結(jié)合，定性定量地檢測(cè)細(xì)胞的基本功能信息。它可以監(jiān)測(cè)單個(gè)活細(xì)胞的生理功能，也可以通過(guò)捕捉細(xì)胞代謝產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)化成電信號(hào)來(lái)確定細(xì)胞濃度大小，如在芯片上通過(guò)培養(yǎng)吸收了已知cDNA，利用生物芯片探針雜交檢測(cè)原理，便可檢測(cè)激動(dòng)劑或抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)的影響。

4 展望

目前，可用于細(xì)胞以及細(xì)胞相互作用分析高靈敏分析檢測(cè)方法已有許多，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。但是實(shí)時(shí)、在線、原位、活體分析細(xì)胞技術(shù)還有待進(jìn)一步發(fā)展和研究，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分析要建立在未受任何外界條件影響的情況下的真實(shí)有效的分析。此外，結(jié)合多個(gè)學(xué)科，研制新型分析儀器，發(fā)展各種檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)在分子水平上研究細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)如蛋白-蛋白、核酸-核酸反應(yīng)等，讓人類從細(xì)胞水平、分子水平上研究生命活動(dòng)的本質(zhì)，從而為生命科學(xué)提供更好和更多的有用信息。

[1] 李 勤,馬 瑜，俞 信，等.數(shù)字化高靈敏度熒光顯微鏡在As2O3誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞核凋亡產(chǎn)生鈣振蕩研究中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器，2004，2(3)：18-21.

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(本文文獻(xiàn)格式：高小麗.細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].山東化工，2017，46(10)：87-88，91.)

The Research Progress of Cell Detection Technology

GaoXiaoli

(Chongqing Chemical Industry Vocational College,400020,China)

With the development of cell Biology, it appears that more and more techniques and methods are applied to studying cells. The main principles, characteristics and application of these techniques and methods are roundly reviewed in this paper.

cell;techniques and methods;application

2017-03-31

高小麗(1979—)，女，四川樂(lè)山人，講師，碩士，從事生物傳感器研究。

Q939.4

A

1008-021X(2017)10-0087-02