趙忠濤　張麗

摘 要：采用盆栽的方法，研究了不同濃度Pb2+脅迫對(duì)早熟禾品種“潤(rùn)草一號(hào)”生理活性的影響。通過檢測(cè)“潤(rùn)草一號(hào)”葉片的葉綠素含量、脯氨酸含量和細(xì)胞膜透性以及根系活力的變化，我們發(fā)現(xiàn)，Pb2+脅迫對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”葉片的生長(zhǎng)影響不明顯，較高濃度處理才會(huì)引起“潤(rùn)草一號(hào)”葉片葉綠素含量、脯氨酸含量和細(xì)胞膜透性的降低。但是，較低濃度的Pb2+處理就能夠顯著地降低“潤(rùn)草一號(hào)”根系活力。

關(guān)鍵詞：“潤(rùn)草一號(hào)” Pb2+ 生理生化指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S688.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2017）02（b）-0113-04

研究表明，重金屬元素很難被生物體所降解。并且重金屬元素還可以在食物鏈的作用下，在生物體內(nèi)層層富集，造成嚴(yán)重的生態(tài)危害。土壤中重金屬元素的污染可能會(huì)導(dǎo)致土壤肥力的降低和流失，作物產(chǎn)量與品質(zhì)降低和劣化，水環(huán)境污染加重等等嚴(yán)重后果。因此，如何修復(fù)土壤的重金屬元素污染，是環(huán)境和生態(tài)保護(hù)所亟待解決的重大課題之一。而在重金屬元素污染較重的區(qū)域種植耐受性較高的植物，特別是非食用性的耐受性較高的植物，是非常有效的恢復(fù)生態(tài)環(huán)境的途徑之一[1-2]。

重金屬元素鉛（Pb）是環(huán)境危害極大的一種常見污染物。隨著城市工業(yè)和交通的日益發(fā)達(dá)（主要來源于化石燃料和汽車尾氣），釋放到環(huán)境中Pb日漸增加。Pb可以在土壤中大量積累，難以被微生物分解代謝，可能會(huì)導(dǎo)致土壤的正常功能失調(diào)、質(zhì)量下降，并且會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害。草地早熟禾（Poa pratensis）是冷季型草坪中最重要的一種，其分布范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)，在城市草坪美化中應(yīng)用廣泛。因此，嘗試?yán)貌萜褐参镄迯?fù)土壤Pb污染，有利于凈化土壤，在美化環(huán)境的同時(shí)也可以獲得生態(tài)效益。

早熟禾主要適宜于南方地區(qū)露地栽培，是我國草坪綠化常用的草坪植物之一。主要用于觀賞草坪的建植，對(duì)于降低環(huán)境污染、城市綠化及美化起著非常重要的作用[4]。“潤(rùn)草一號(hào)”是一種新型的早熟禾品種，于2012年由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院培育而成?！皾?rùn)草一號(hào)”屬于低矮型草種，抗倒伏和抗病能力強(qiáng)，坪用性狀優(yōu)良，具有較強(qiáng)的耐蔭、耐熱性能。該研究以“潤(rùn)草一號(hào)”為實(shí)驗(yàn)材料，研究了其在不同濃度的Pb2+脅迫的生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律。該研究結(jié)果為今后開發(fā)利用“潤(rùn)草一號(hào)”用于Pb2+污染的土壤修復(fù)提供了理論依據(jù)，為“潤(rùn)草一號(hào)”在城市地區(qū)園林的廣泛應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草地早熟禾品種為“潤(rùn)草一號(hào)”，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供。供試土壤取自學(xué)院花房土質(zhì)較好的表層土壤，Pb2+添加形式為Pb（Ac）2，分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

室外盆栽試驗(yàn)于2014年9月～2014年11月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。供試土壤風(fēng)干后過0.5 cm篩，按照1∶3將草炭土和土壤混合配制，并稱重5.0 kg裝入花盆中，以不使用Pb2+處理作為對(duì)照，Pb2+濃度梯度均為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、500 mg/kg和1 000 mg/kg，每個(gè)處理濃度3次重復(fù)。平衡土壤半個(gè)月。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 葉片中葉綠素含量的測(cè)定

稱取新鮮葉片0.2 g于研缽中，加入少量碳酸鈣粉和石英砂，加入2～3 mL的95%乙醇，研磨成勻漿。濾紙過濾到25 mL棕色容量瓶中，并用少量乙醇處理研缽、研棒、殘?jiān)蜑V紙上的葉綠體色素，直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。乙醇定容，搖勻。將提取液倒入比色杯內(nèi)，以95%乙醇為空白，分別在665 nm和649 nm和470 nm下測(cè)定吸光度。平行重復(fù)三組[5]。

1.3.2 脯氨酸含量的測(cè)定

取剪碎混勻的新鮮葉片0.2 g置于大試管中，加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液；管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提15 min。待冷卻至室溫后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸和3 mL茚三酮顯色液，于沸水浴中加熱15 min。冷卻后各加入5 mL甲苯，搖勻萃取，避光靜置待完全分層。用移液槍吸取甲苯層液體于石英比色皿中，于520 nm處測(cè)定吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出脯氨酸含量。平行重復(fù)三組[5]。

1.3.3 細(xì)胞膜透性的測(cè)定

選取新鮮葉片若干吸干，剪下后拭凈，用電子天平稱稱取兩份，各重2 g。一份放入40 ℃恒溫箱內(nèi)萎焉1 h，另一份放在燒杯中在室溫下做對(duì)照。處理后分別用蒸餾水沖洗，準(zhǔn)確加入20 mL蒸餾水，浸沒葉片。用真空抽氣泵抽氣7～8 min，使細(xì)胞中的空氣被抽出，使葉片全部浸人重蒸餾水中。在室溫下靜置20 min，然后用DDS-11D型電導(dǎo)儀測(cè)定溶液的電導(dǎo)率R，再將其置于沸水浴中煮沸15 min，冷卻后測(cè)定其電導(dǎo)率R。平行重復(fù)三組[5]。

1.3.4 細(xì)根系活力的測(cè)定

取新鮮根樣品0.5 g放入燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒，在37 ℃下暗處保溫1 h。然后加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反應(yīng)。把根取出，吸干后與乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂一起研磨。將紅色提取液以乙酸乙酯洗滌2～3次，最后加乙酸乙酯定容至10 mL。在485 nm下比色，以空白處理作為參比讀出吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出四氮唑還原量。平行重復(fù)三組[5]。

2 結(jié)果

2.1 Pb2+脅迫下“潤(rùn)草一號(hào)”葉片中葉綠素含量的變化

4種不同濃度的Pb2+溶液脅迫對(duì)葉綠素含量的作用效果可見圖1。在Pb2+溶液處理之后，“潤(rùn)草一號(hào)”葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量，在較低Pb2+溶液濃度（<200 mg/kg）下呈緩慢下降的趨勢(shì)；而在較高濃度Pb2+（>200 mg/kg）處理時(shí)，葉綠素含量明顯下降。Pb2+本身并不是植物的必需元素，在Pb2+脅迫下，葉片色素對(duì)Pb2+處理的敏感程度依次為：類胡蘿卜素<葉綠素a<葉綠素b。

在高濃度的Pb2+脅迫下，“潤(rùn)草一號(hào)”體內(nèi)的葉綠素含量呈下降趨勢(shì)。Pb2+導(dǎo)致“潤(rùn)草一號(hào)”葉片中葉綠素含量下降的可能因素有多種。我們推測(cè)是，Pb2+被植物吸收后，細(xì)胞內(nèi)的Pb2+離子作用于葉綠素生成途徑的酶。Pb2+離子通過改變?nèi)~綠素合成相關(guān)酶的正常構(gòu)型，抑制了相關(guān)酶的活性，進(jìn)而阻礙了葉綠素的合成。

有研究表明，早熟禾葉片對(duì)光的吸收來源于其中的葉綠體。而葉綠體的變化過程與葉綠素含量、光合速率降低及其結(jié)構(gòu)的破壞密切相關(guān)。因此，在重金屬脅迫處理后，會(huì)造成葉綠素含量下降及結(jié)構(gòu)的破壞，影響光合反應(yīng)效率。甚至可能影響植物的光合系統(tǒng)、保護(hù)酶系統(tǒng)以及物質(zhì)代謝系統(tǒng)等，改變植物正常生理狀態(tài)，甚至導(dǎo)致植物死亡[6]。

2.2 Pb2+脅迫下“潤(rùn)草一號(hào)”葉片脯氨酸含量的變化

脯氨酸參與了調(diào)節(jié)植物體內(nèi)滲透平衡，是在維持細(xì)胞滲透壓方而起著相當(dāng)重要作用的一類物質(zhì)。并且植物體內(nèi)的脯氨酸含量可以用作植物對(duì)外界環(huán)境重金屬脅迫響應(yīng)的重要指標(biāo)之一[7]。從圖2可以看出，在Pb2+脅迫下，“潤(rùn)草一號(hào)”葉片內(nèi)脯氨酸的含量隨著Pb2+濃度的升高不斷上升，在Pb2+處理濃度為100 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值。而當(dāng)Pb2+處理濃度大于100 mg/kg時(shí)，葉片中脯氨酸含量又會(huì)逐漸下降。

2.3 Pb2+脅迫下“潤(rùn)草一號(hào)”葉片細(xì)胞膜透性的變化

植物細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物細(xì)胞和外界環(huán)境相隔離的屏障，也執(zhí)行著細(xì)胞和外界環(huán)境進(jìn)行信息傳遞和物質(zhì)交換的功能。細(xì)胞膜的穩(wěn)定性是維持細(xì)胞內(nèi)外平衡和正常生理功能的基礎(chǔ)[8]。重金屬脅迫可以破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加。細(xì)胞膜透性的變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜上結(jié)合酶和細(xì)胞內(nèi)酶的失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)外平衡性喪失，導(dǎo)致一系列生理生化過程紊亂，甚至導(dǎo)致植株死亡[9]。在該研究中，我們發(fā)現(xiàn)在Pb2+脅迫處理下，“潤(rùn)草一號(hào)”葉片組織外滲液的電導(dǎo)率隨Pb2+濃度的增加而升高，呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系。其原因可能是Pb2+與細(xì)胞膜蛋白的巰基或磷脂分子層的磷脂類物質(zhì)反應(yīng)，改變膜蛋白的磷脂結(jié)構(gòu)。而磷脂結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，使得細(xì)胞膜透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲，從而引起電導(dǎo)率的變化[3，10]（見圖3）。

2.4 Pb2+脅迫對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”根系活力的影響

根系是植物的六大器官之一，主要功能包括吸收水分和肥料以及支持植物體生長(zhǎng)等。對(duì)于草坪植物來說，發(fā)達(dá)的根系對(duì)于植物抵御大風(fēng)侵蝕和雨水沖刷，保持水土具有更加重要的作用。而土壤中的重金屬污染，最主要的影響就是危害植物根系，可能導(dǎo)致根系活力降低和主動(dòng)吸收能力下降[11]。

從圖4可以看出，不同濃度的Pb2+處理后，潤(rùn)草1號(hào)的根系活力低于對(duì)照組，隨著重金屬鎘濃度的逐浙增大，根系活力表現(xiàn)為逐漸降低。當(dāng)重金屬鎘濃度小于50 mg/kg時(shí)，根系活力是與對(duì)照組相近的，這說明對(duì)潤(rùn)草1號(hào)的影響很小。“潤(rùn)草一號(hào)”的根系活力則呈下降趨勢(shì)，濃度越高，根系活力越低。究其原因可能是，在Pb2+脅迫下，產(chǎn)生的自由基超過“潤(rùn)草一號(hào)”自身抗氧化系統(tǒng)酶的清除能力。多余的自由基會(huì)對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”根系代謝中的琥珀酸脫氫酶等造成傷害，從而使根系活力下降[11]。

3 討論與結(jié)論

從以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在該研究實(shí)驗(yàn)中，重金屬Pb2+脅迫處理對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”不同部分生長(zhǎng)的影響并不完全一致。較低濃度（<200 mg/kg）的Pb2+處理對(duì)于“潤(rùn)草一號(hào)”葉片的葉綠素含量、脯氨酸含量和細(xì)胞膜透性影響不顯著；而高濃度（>200 mg/kg）的Pb2+對(duì)葉綠素含量、脯氨酸含量和細(xì)胞膜透性影響較為明顯。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Pb2+脅迫對(duì)于“潤(rùn)草一號(hào)”葉片生理指標(biāo)作用效果不明顯，只有在較高濃度下才會(huì)對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”葉片生理指標(biāo)產(chǎn)生明顯影響。

葉綠素含量的多少在一定程度上反映了植物光合作用的強(qiáng)弱，它也直接影響著草坪物的綠度。當(dāng)處理濃度低于200 mg/kg時(shí)，Pb2+對(duì)葉綠素合成影響不大，葉片中的葉綠素含量相比于對(duì)照降低不明顯。當(dāng)處理濃度高于200 mg/kg時(shí)，Pb2+對(duì)葉綠素合成具有抑制作用開始顯現(xiàn)，葉片中的葉綠素含量隨處理濃度的增加而減少。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，有可能是高濃度的Pb2+離子會(huì)抑制 “潤(rùn)草一號(hào)”合成葉綠素通路的關(guān)鍵酶的活性，影響葉綠素的合成，導(dǎo)致了“潤(rùn)草一號(hào)”葉片中葉綠素含量的下降[12]。而“潤(rùn)草一號(hào)”葉片中脯氨酸含量隨著Pb2+離子濃度增加，呈現(xiàn)先升高再降低的變化過程，這可能是由于脯氨酸在植物體內(nèi)作用決定的。低濃度Pb2+脅迫會(huì)刺激“潤(rùn)草一號(hào)”葉片中脯氨酸含量上升，對(duì)植物本身產(chǎn)生一種逆境保護(hù)作用。而高濃度Pb2+脅迫超過了植株本身的耐受范圍，可以不可逆地破壞“潤(rùn)草一號(hào)”葉片中的相關(guān)生物酶活性，影響正常生理過程，導(dǎo)致葉片中脯氨酸含量降低。

但是Pb2+處理對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”根系生長(zhǎng)的抑制作用則非常顯著。當(dāng)Pb2+濃度>50 mg/kg時(shí)，“潤(rùn)草一號(hào)”的根系活力就發(fā)生明顯的降低。相比較而言， Pb2+對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”根系的影響遠(yuǎn)大于對(duì)于其葉片的影響，這可能與“潤(rùn)草一號(hào)”植株對(duì)于Pb2+吸收分布不一致相關(guān)。相同濃度的Pb2+離子處理“潤(rùn)草一號(hào)”植株，Pb2+分布并不均勻，較容易富集于“潤(rùn)草一號(hào)”的根部，葉片部位分布較少。所以，“潤(rùn)草一號(hào)”的根系部分受Pb2+離子影響更明顯，而葉片部分相對(duì)來說較不敏感。而“潤(rùn)草一號(hào)”根系對(duì)Pb2+離子敏感的原因可能是：在Pb2+脅迫下，產(chǎn)生的自由基超過“潤(rùn)草一號(hào)”自身抗氧化系統(tǒng)酶的清除能力。多余的自由基會(huì)對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”根系代謝中的琥珀酸脫氫酶等造成傷害，從而使根系活力下降[11]。

草坪植物綠度與根系生長(zhǎng)是衡量草坪植株是否具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的最為重要的指標(biāo)之一。該研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Pb2+對(duì)“潤(rùn)草一號(hào)”根系生長(zhǎng)的抑制作用尤為明顯。因此，在實(shí)際使用中，“潤(rùn)草一號(hào)”草坪土壤中的Pb2+含量應(yīng)控制在50 mg/kg以下，以利于“潤(rùn)草一號(hào)”植株的正常生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)

[1] Chander K，Dychmans J，Joergensen RG，et al.Different sources of heavy metals and their long-term effects on soil microbial properties[J].Biology and Fertility of Soils， 2001，34（4）：241-247.

[2] Chen SH，Zhou QX，Sun TH，et al.Rapid ecotoxicological assessment of heavy metal combined polluted soil using canonical analysis[J].Journal of Environmental Sciences， 2003，15（6）：854-858.

[3] 劉俊祥，孫振元，韓蕾，等.草坪草對(duì)重金屬脅迫響應(yīng)的研究現(xiàn)狀[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（13）：142-145.

[4] 陳樹國，李瑞華，楊秋生.觀賞園藝學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1991：206-224.

[5] 鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000.

[6] 楊居榮，賀建新，蔣婉茹.鎘污染對(duì)植物生理生化的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，1995，14（5）：193-197.

[7] 紀(jì)淑梅.草坪草耐鹽性研究：II.鹽脅迫對(duì)草坪草脯氨酸含量的影響[J].草業(yè)科學(xué)，1999，16（12）：54-59.

[8] 暢世勇，王方，晰建春.重金屬對(duì)值物的毒害及值物的耐性機(jī)制[J].環(huán)境科學(xué)報(bào)，2004，27（1）：71-72.

[9] 劉萬玲.重金屬污染及其對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（16）：4026-4027.

[10] 王新，周啟星，陳濤.污泥土地利用對(duì)草坪草及土壤的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2003，24（2）：50-53.

[11] 努扎艾提·艾比布，劉云國，宋華曉，等.重金屬Zn Cu對(duì)香根草生理生化指標(biāo)的影響及其積累特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（1）：54-59.

[12] 多立安，高玉葆，趙樹蘭.早熟禾對(duì)4種重金屬脅迫生長(zhǎng)響應(yīng)特征[J].西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（1）：183-187.