寧春花，金圣，秦玉杰，鐘超，張奎

（1.常熟理工學院化學與材料工程學院，江蘇 常熟 215500；2.江蘇省新型功能材料重點建設(shè)實驗室，江蘇 常熟 215500）

聚乙二醇修飾樹枝狀聚（胺-酯）與牛血清白蛋白結(jié)合作用的研究

寧春花1，2，金圣1，秦玉杰1，鐘超1，張奎1

（1.常熟理工學院化學與材料工程學院，江蘇 常熟 215500；2.江蘇省新型功能材料重點建設(shè)實驗室，江蘇 常熟 215500）

以端基為8個伯氨基的樹枝狀化合物［PAE（NH2）8］和聚乙二醇-600（PEG-600）為原料合成了聚乙二醇修飾的樹枝狀聚（胺-酯）（PAE-PEG）.通過正交實驗討論了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及原料配比對產(chǎn)物產(chǎn)率的影響.用熒光光譜法研究了PAE-PEG與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用.實驗結(jié)果表明，PAE-PEG的加入使BSA發(fā)生熒光猝滅，其猝滅機制屬于靜態(tài)猝滅，通過計算得到PAE-PEG與BSA作用的動態(tài)猝滅常數(shù)為18.55 L/mmol.通過同步熒光研究發(fā)現(xiàn)，PAE-PEG的存在會改變BSA的構(gòu)象.此外還考察了體系的pH值和離子強度對PAE-PEG與BSA相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)合的主要作用機制是靜電作用.研究了金屬離子Cu2+、Fe3+對PAE-PEG與BSA之間相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)金屬離子的存在并不改變兩者的結(jié)合位點數(shù)，BSA和PAE-PEG之間的結(jié)合位點數(shù)均近似為0.7.

PEG；樹枝狀聚（胺-酯）；牛血清白蛋白；熒光光譜

聚乙二醇（PEG）是一類無毒、生物相容、無刺激性、免疫原性低的水溶性聚合物.樹枝狀大分子是一類結(jié)構(gòu)規(guī)整、單分散性、徑向?qū)ΨQ的納米級大分子，其端基具有活性基團，可以通過修飾連接抗體或基因等生物活性分子.同時樹枝狀大分子本身具有穩(wěn)定性，無免疫原性和高的生物活性劑轉(zhuǎn)運效率，因此其已成為一種廣泛、有效的藥物載體［1-2］.PEG修飾樹枝狀大分子形成具有疏水性內(nèi)核、親水性殼的單分子膠束，可用于增加藥物溶解度用于藥物轉(zhuǎn)運體系，同時也能克服其他物質(zhì)修飾樹枝狀大分子所帶來的溶血毒性和細胞毒性等缺點，將成為一種更有發(fā)展前途的藥物載體［3-4］.因此，研究PEG修飾的樹枝狀大分子對人類健康更具有意義.

血清白蛋白是生命體血漿中最為豐富的蛋白質(zhì)，它能與許多內(nèi)源及外源化合物結(jié)合，具有重要的存貯運輸功能.在體內(nèi)起著保持酸度，貯存和運載金屬離子、氨基酸、藥物等重要作用，是基礎(chǔ)科學研究中最常用的藥物靶蛋白之一.牛血清白蛋白（BSA）與許多小分子物質(zhì)發(fā)生相互作用研究的報道很多，然而與大分子，特別是樹枝狀大分子的研究很少.

本文通過一步法以乙二胺和三羥甲基丙烷三丙烯酸酯為原料合成端氨基樹枝狀聚（胺-酯），與傳統(tǒng)方法相比，無需官能團的保護-解保護，簡化了合成步驟.通過熒光光譜法研究其對牛血清白蛋白熒光猝滅作用，探討此體系的猝滅機制及PAE-PEG存在對于BSA構(gòu)象的變化.此外，還研究pH值和金屬離子的存在對BSA與PAE-PEG之間相互作用的影響.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

端基為8個伯氨基的樹枝狀聚（胺-酯）（PAE（NH2）8），實驗室自制［5］；聚氧乙烯（654）（PEO-A（654））：實驗室自制［6］；PEG-600，AR，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；BSA，生化試劑，上海眾華生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷，AR，上海化學試劑站分裝廠；其余試劑均為AR.

1.2 PAE-PEG的合成

1.2.1 合成路線

以甲醇為溶劑，以PAE（NH2）8和PEG-600為原料進行加成反應(yīng)，反應(yīng)式如圖1所示.

圖1 PAE-PEG的合成路線

PAE（NH2）8：端基為8個伯氨基的樹枝狀聚（胺-酯）；PEO-A（654）：聚氧乙烯（654）

表1 正交設(shè)計因素水平表

1.2.2 合成方法

稱取2.5 g PAE（NH2）8溶于50 mL甲醇，加入到帶有攪拌裝置的250 mL三口燒瓶中，在氮氣保護下，緩慢滴入10 mL 0.2 mol/L的PEO-A（654）甲醇溶液，50℃反應(yīng)72 h，減壓蒸餾，產(chǎn)物用無水乙醚沉淀純化，40℃真空干燥48 h，得淡黃色黏狀液體PAE-PEG.表1為其正交設(shè)計因素水平表.

1.3 PAE-PEG與BSA的相互作用

1.3.1 PAE-PEG對BSA熒光的猝滅作用

將BSA溶解于含有100 mmol/L NaCl的pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，配成濃度為5 μmol/L的溶液.取2.5 mL BSA溶液于1 cm比色皿中，然后分別向溶液中加入不同濃度的PAE-PEG溶液，以295 nm為激發(fā)波長，記錄300～400 nm范圍內(nèi)加入PAE-PEG前后BSA的熒光發(fā)射光譜.

1.3.2 同步熒光考察PAE-PEG對BSA氨基酸殘基微環(huán)境的影響

固定熒光發(fā)射與激發(fā)波長的差值（Δλ）分別為15，60 nm時，分別測定上述BSA溶液的同步熒光光譜.然后向BSA溶液中加入不同濃度的PAE-PEG溶液，在同樣條件下測定其同步熒光光譜.

1.3.3 pH值和離子強度對PAE-PEG與BSA相互作用的影響

將BSA分別溶于不同pH值或含有不同濃度NaCl的pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，配成5 μmol/L的溶液，測定其熒光發(fā)射光譜.

1.3.4 Cu2+和Fe3+對PAE-PEG與BSA相互作用的影響

在BSA溶液中加入一定體積的金屬離子Cu2+或Fe3+溶液，使金屬離子與BSA的摩爾比為1：1.然后再加入不同體積的10 μmol/L PAE-PEG溶液，在同樣測定條件下測定BSA的熒光發(fā)射光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 PAE-PEG正交實驗數(shù)據(jù)分析

由表2可知，反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及摩爾配比三因素對反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響順序為：反應(yīng)時間＞反應(yīng)溫度＞摩爾配比.由正交表可以確定PAEPEG反應(yīng)最佳條件分別為221.所以，最佳反應(yīng)條件為：n［PAE（NH2）8］：n［PEO-A（654）］=1：16，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為72 h，此條件下合成產(chǎn)物產(chǎn)率達到58.33%.

表2 PAE-PEG合成實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析

2.2 PAE-PEG的FTIR表征

產(chǎn)物的FTIR譜圖見圖2.曲線a中3454 cm-1處為O-H的特征峰；1720 cm-1處為C=O的特征峰；1640 cm-1處為C=C的特征峰；1069，953，864 cm-1處為C-OC的特征峰.結(jié)果表明，PEO-A（654）中具有羰基、雙鍵和醚結(jié)構(gòu)的特征.曲線b中3412 cm-1處為酰胺中-NH-的特征峰；1720 cm-1處為C=O的特征峰；1294 cm-1處為C-O-C的特征峰.對比曲線a和曲線b，可知PAE（NH2）8與PEO-A（654）發(fā)生了加成反應(yīng).

2.3 PAE-PEG對BSA的熒光猝滅機理

熒光猝滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的熒光強度下降的現(xiàn)象，引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑.BSA含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等芳香氨基酸殘基而發(fā)射較強的內(nèi)源熒光.以295 nm為激發(fā)波長得到的是色氨酸殘基的熒光發(fā)射光譜，而PAE-PEG自身在此范圍內(nèi)無熒光，因此對實驗結(jié)果并不產(chǎn)生干擾.

圖3是不同濃度的PAE-PEG對BSA的熒光猝滅圖.由圖可知，隨著PAE-PEG濃度的不斷增大，BSA的熒光強度逐漸降低，而發(fā)射峰的位置峰形不變.這表明PAE-PEG對BSA有熒光猝滅作用.

圖2 PAE-PEG的紅外光譜圖

圖3 PAE-PEG對BSA的熒光猝滅圖

Stern-Volmer方程式為F0/F=1+Ksv［Q］，式中F0和F分別為不存在和存在PAE-PEG情況下的熒光強度，Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)；［Q］為PAE-PEG的濃度.根據(jù)計算得出PAE-PEG與BSA作用的動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv為18.55 L/mmol，遠遠大于各種猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅過程的猝滅常數(shù)0.2 L/mmol，由此推斷BSA熒光猝滅過程不是PAE-PEG擴散時所引起的動態(tài)猝滅，而是形成了復合物引起的靜態(tài)猝滅.

雙代數(shù)方程為log［（F0-F）/F］=logKa+nlog［Q］，式中Ka為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù).以log［（F0-F）/F］）對log［Q］作圖，可以求得PAE-PEG與BSA之間的Ka和n.圖4是PAE-PEG對BSA熒光猝滅的雙對數(shù)曲線圖，根據(jù)圖4求得PAE-PEG和BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)為11.66 L/ mmol，結(jié)合位點數(shù)為0.70.

圖4 PAE-PEG對BSA熒光猝滅雙對數(shù)曲線圖

2.4 PAE-PEG對BSA構(gòu)象的影響

同步熒光能夠提供生色團周圍微環(huán)境極性變化的影響情況，可以根據(jù)氨基酸發(fā)射波長的改變考察PAE-PEG對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響［7］.當Δλ=15 nm時，所作出的同步熒光光譜是酪氨酸殘基的光譜特性，當Δλ=60 nm時，所作出的同步熒光光譜是色氨酸殘基的光譜特性.圖5為Δλ=15和60 nm條件下，BSA、PAE-PEG體系中BSA的同步熒光光譜.由圖5可以看出，隨著PAE-PEG濃度的不斷增加，BSA的熒光強度都降低，且酪氨酸殘基（Δλ=15 nm）的最大發(fā)射波長發(fā)生藍移（18 nm），色氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生輕微的紅移（1 nm），PAE-PEG的加入使酪氨酸和色氨酸的微環(huán)境發(fā)生了變化，從而導致BSA的構(gòu)象也發(fā)生了變化.

2.5 pH值和離子強度對PAE-PEG與BSA相互作用的影響

圖5 PAE-PEG與BSA相互作用的同步熒光光譜

血漿中pH值的變化和微量金屬離子會影響蛋白與配體的相互作用［8］.圖6、7為pH值和離子強度對PAE-PEG與BSA相互作用的影響圖.由圖6可知，當pH值從6.2下降至7.4時，Ksv呈下降趨勢；當pH值從7.4上升至8.6時，Ksv呈上升趨勢.在整個6.2～8.6的pH值范圍內(nèi)，猝滅程度變化趨勢沒有明顯規(guī)律.這是因為pH值在6.2～8.6時，PAEPEG中的亞氨基都質(zhì)子化后帶正電荷，而BSA中羧基都帶負電荷，兩者會產(chǎn)生靜電作用.當pH值為7.4時，兩者的相互作用最強，BSA內(nèi)源熒光猝滅作用最強.同時，也能看出pH值的變化使BSA氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生變化.

由圖7可知，NaCl的濃度在100 mmol/L時，PAE-PEG與BSA相互作用的Ksv最大，但隨著NaCl濃度的增大，Ksv逐漸減小，由此說明PAE-PEG與BSA是以靜電作用相結(jié)合的.隨著溶液中Na+和Cl-離子強度的增加，Na+可與PAE-PEG中的亞銨陽離子競爭結(jié)合BSA中的羧酸根離子，從而減弱了兩者的相互作用.

2.6 Cu2+、Fe3+對PAE-PEG與BSA之間相互作用的影響

圖8為PAE-PEG對BSA的熒光猝滅圖.圖8（a）和圖8（b）分別為Cu2+和Fe3+存在時PAE-PEG對BSA熒光猝滅圖.在金屬離子的存在下，加入PAE-PEG后BSA內(nèi)源熒光強度的變化可以考察金屬離子對PAEPEG與BSA之間相互作用的影響.對比圖1和圖8（a）、8（b）可以看出，隨著PAE-PEG濃度的增加，BSA的熒光強度逐漸降低，但峰位不變，表明無論有無金屬離子，PAE-PEG均能夠猝滅BSA的內(nèi)源性熒光.

從表5可以看出，在Cu2+存在的情況下，PAE-PEG與BSA的結(jié)合常數(shù)比不存在Cu2+時僅降低了5.06%；在Fe3+存在的情況下，PAE-PEG與BSA的結(jié)合常數(shù)與不存在Fe3+時相差較多，降低了33.88%，說明Cu2+的存在幾乎不影響PAE-PEG與BSA的結(jié)合，而Fe3+存在會稍微降低兩者的結(jié)合能力.這可能是因為Fe3+的存在使BSA的構(gòu)象發(fā)生了改變，也可能是Fe3+與PAE-PEG競爭結(jié)合BSA.而不管有無金屬離子存在，PAE-PEG和BSA之間的結(jié)合位點數(shù)均近似為0.70，說明金屬離子的存在并不改變兩者的結(jié)合位點數(shù).

圖6 pH值對PAE-PEG與BSA相互作用的影響

圖7 離子強度對PAE-PEG與BSA相互作用的影響

圖8 PAE-PEG對BSA內(nèi)源性熒光猝滅圖

表5 金屬離子條件下PAE-PEG和BSA相互作用的動態(tài)猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

3 結(jié)論

（1）利用PEG-600修飾PAE（NH2）8得PAE-PEG，其最佳反應(yīng)條件為：以甲醇為溶劑，n［PAE（NH2）8］：n［（PEO-A（654）］=1∶16，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為72 h，產(chǎn)物產(chǎn)率為58.33%.

（2）PAE-PEG與BSA之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，主要通過靜電作用方式與BSA結(jié)合，使其內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅.同步熒光結(jié)果也說明了PAE-PEG的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生改變.

（3）在生理條件下，采用熒光光譜研究了Cu2+、Fe3+對PAE-PEG與BSA相互作用的影響，結(jié)果表明PAEPEG對BSA的猝滅是靜態(tài)猝滅，金屬離子的存在不改變兩者的作用類型和結(jié)合位點數(shù).

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On the Interaction between Dendritic Poly(amine-ester)Modified by Polyethylene Glycol and Bovine Serum Albumin

NING Chunhua1,2,JIN Sheng1,QIN Yujie1,ZHONG Chao1,ZHANG Kui1
(1.School of Chemistry and Material Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500; 2.Jiangsu Laboratory of Advanced Functional Materials,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Dendritic poly(amine-ester)modified by polyethylene glycol(PAE-PEG)was synthesized from a dendrimer with 8 primary amines as the terminal group[PAE(NH2)8]and polyethylene glycol-600(PEG-600).The effects of the reaction temperature,the reaction time and the ratio of reactants on the yield of products were investigated by an orthogonal experiment.The interaction between PAE-PEG and bovine serum albumin(BSA)was studied by fluorescence spectroscopy.It was found that the fluorescence intensity of BSA decreased after the addition of PAE-PEG and the quenching mechanism was suggested as static quenching.The dynamic extinction constant of PAE-PEG with BSA was calculated to be 18.55 L/mmol.At the same time,synchronous fluorescence was adopted to review the conformational changes of BSA influenced by PAE-PEG.The results indicated that PAE-PEG could change the conformation of BSA,and make the tryptophan residue become more hydrophobic.Furthermore,this paper also examined the influence of pH and ionic strength on the interactions,from which it was concluded that electrostatic interaction played major roles in the binding process.The effects of Cu2+and Fe3+on the interaction between PAE-PEG and BSA were studied,and the results showed that different metal ions had different effects on the interaction between PAE-PEG and BSA,and that metal ions did not change the binding sites of PAE-PEG and BSA,which was approximately 0.7.

PEG;poly(amine-ester);bovine serum albumin;fluorescence spectroscopy

TQ317

A

1008-2794（2017）02-0109-06

2015-09-12

江蘇省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目“PEG化樹枝狀聚（胺-酯）的合成及性能研究”（20141033336）

寧春花，副教授，碩士，研究方向：樹枝狀大分子的合成及應(yīng)用，E-mail：chunhuaning@163.com.