摘 要 近年來，有機磷水解酶越來越多地被展示到不同的細(xì)胞表面。對有機磷水解酶的細(xì)胞表面展示技術(shù)的原理，大腸桿菌、假單胞菌、酵母菌等幾種細(xì)胞表面展示有機磷水解酶系統(tǒng)的研究概況進行綜述。

關(guān)鍵詞 有機磷廢水；有機磷水解酶；細(xì)胞表面展示

中圖分類號：Q556 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.1.005

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20170123.1746.007.html 網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-1-23 17：46：00

有機磷水解酶（EC 3.1.8.1）最早是從黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）和缺陷假單胞菌屬（Pseudomonas diminuta）中分離出來的，能特異性水解一系列有機磷酯類物質(zhì)。同時有機磷水解酶具有廣譜的底物特異性，能夠斷裂P-0、P-S、P-F和P-CN鍵，能夠催化甲基對硫磷、對硫磷、磷胺類等物質(zhì)水解成對硝基苯酚和磷酯類物質(zhì)，從而實現(xiàn)對有機磷農(nóng)藥的降解，因此被廣泛地應(yīng)用于有機磷廢水的處理[1]。目前，有機磷水解酶大量地用于有機磷廢水處理，但同時也存在一個問題，即有機磷水解酶是一個膜蛋白，在實際應(yīng)用時需要用復(fù)雜的方法將其提取與純化出來，成本較高，并且在提取與純化的過程中酶易失活。盡管有報道稱可以通過基因工程技術(shù)對有機磷水解酶進行重組改造，使其能在胞內(nèi)實現(xiàn)可溶性表達(dá)，但同樣也存在純化過程復(fù)雜、成本代價高、酶易失活等問題。近年來，細(xì)胞表面展示技術(shù)的發(fā)展克服了上述問題，即將有機磷水解酶展示到細(xì)胞表面，直接作為全細(xì)胞催化劑應(yīng)用于有機磷農(nóng)藥廢水的處理。為此，筆者對有機磷水解酶表面展示技術(shù)以及幾種常見的表面展示系統(tǒng)進行介紹，為更好地利用全細(xì)胞催化劑降解有機磷廢水提供一定的參考。

1有機磷水解酶的表面展示研究

1.1有機磷水解酶表面展示技術(shù)

細(xì)胞表面展示系統(tǒng)包含3個基本的元件：宿主菌、乘客蛋白、運載蛋白，其中宿主菌主要作為乘客蛋白和運載蛋白結(jié)合的載體，乘客蛋白是要展示到細(xì)胞表面的目的蛋白，運載蛋白主要是與乘客蛋白相結(jié)合，并將目的蛋白運送到細(xì)胞表面實現(xiàn)固定。細(xì)胞表面展示的過程實質(zhì)是蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運的過程，其中涉及到不同蛋白質(zhì)分泌轉(zhuǎn)運。據(jù)報道，有機磷水解酶已經(jīng)成功地展示到大腸桿菌、假單胞菌、酵母菌以及某些藻類中，并且展示到細(xì)胞表面的有機磷水解酶有較高的生物活性[2]。

1.2大腸桿菌表面展示有機磷水解酶

大腸桿菌因細(xì)胞結(jié)構(gòu)較簡單，遺傳背景被研究得較為透徹。因此，常作為工程菌在研究中使用，大腸桿菌不僅可以高效地表達(dá)外源蛋白質(zhì)，而且也成為最常用的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)。

黎小軍等從黃桿菌ATCC27551中克隆出有機磷水解酶基因opd，并將其直接與XcmⅠ酶切去除Ampr抗性基因片段的pZXL-T載體相連，這樣opd基因被成功克隆于錨定單元Lpp-OmpA編碼序列下游，最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，重組的大腸桿菌能表達(dá)產(chǎn)生51 kDa的融合蛋白，而且還具有全細(xì)胞生物活性。在以對氧磷為底物的酶活檢測實驗中，其酶活（酶活力單位定義為：每分鐘水解1 μmol對氧磷所需酶量）達(dá)到0.018 U/OD600，而作為對照的空宿主菌沒有檢測出有機磷水解酶活性[3]。

1.3酵母菌表面展示有機磷水解酶

在眾多的微生物表面展示系統(tǒng)中，釀酒酵母表面展示系統(tǒng)對蛋白的裝配有嚴(yán)格的調(diào)控，并且可以對展示的蛋白質(zhì)進行一些修飾，這樣展示的蛋白質(zhì)就具有更多的生物活性。同其他展示系統(tǒng)相比，其表面展示蛋白質(zhì)分子量更大。因此，酵母表面展示系統(tǒng)也越來越廣泛地被應(yīng)用。

Takeshi Fukuda等利用Flo1p錨定單元，構(gòu)建了Flo1p-OPH重組質(zhì)粒，成功地將有機磷水解酶展示到酵母表面。以對氧磷為底物，重組菌的酶活（酶活力單位定義為：每毫克細(xì)胞干重每分鐘生成1 nmol對硝基苯酚所需的酶量）達(dá)到2000 U/（mg細(xì)胞干重），這比之前報道的用GPI錨定單元，展示有機磷水解酶的全細(xì)胞生物酶催化活性高8倍[4]。因此，F(xiàn)lo1p錨定單元可以很好地用于有機磷水解酶表面展示。Xing-Xing Wang等以冰核蛋白N端序列作為錨定位點，將甲基對硫磷水解酶（MPH）展示到解脂耶氏酵母表面，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，其全細(xì)胞甲基對硫磷水解酶的活力（酶活力單位定義為：在35℃時，每分鐘產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需要的展示酶量）為450.6 U/mL培養(yǎng)基，重組菌的最適溫度為40℃、最適pH為9.5，當(dāng)重組菌的OD600為2.6、甲基對硫磷的濃度為100 mg/L時，在30 min以內(nèi)大約有90.8%的甲基對硫磷被水解[5]。這表明重組菌全細(xì)胞生物催化活性很高。

1.4假單胞菌表面展示有機磷水解酶

惡臭假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌，其自身結(jié)構(gòu)較簡單，遺傳背景比較清楚，全基因組測序已經(jīng)完成。由于惡臭假單胞菌具有較強的抗逆性能，能在極端環(huán)境條件下生長繁殖，若在其表面展示有機磷水解酶，那么重組菌就能更穩(wěn)定、更長時間地處理有機磷農(nóng)藥廢水[6]。

Yulan Yuan等構(gòu)建了具有綠色熒光蛋白、有機磷水解酶、冰核蛋白的融合載體（INPNC-OPH-GFP），并將其展示到具有降解對硝基苯酚（PNP）能力的惡臭假單胞菌（P. putida JS444）細(xì)胞表面，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，展示到細(xì)胞表面的重組蛋白既沒有抑制細(xì)胞的生長，其本身的生物活性也幾乎沒有損失。在含有100 mg/kg對硫磷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組工程菌，不到15 d的時間，對硫磷就被完全降解[7]。

2展望

有機磷水解酶表面展示技術(shù)發(fā)展越來越迅速，目前，有報道稱有機磷水解酶已經(jīng)成功地展示到藍(lán)藻細(xì)胞表面，這種新的展示系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，為有機磷水解酶的應(yīng)用提供了新的方向。由于將有機磷水解酶展示到細(xì)胞表面，不僅克服了有機磷廢水不能透過細(xì)胞膜等問題，而且重組工程菌和廢水的接觸面積增大，這樣更有利于催化水解反應(yīng)的進行，大大提高降解的效率?，F(xiàn)在，因為重組菌具有全細(xì)胞生物催化活性，而被廣泛用于生物傳感器，用來檢測廢水中有機磷的濃度。但目前，有機磷水解酶表面展示技術(shù)還存在著不足，一些展示系統(tǒng)的遺傳背景較復(fù)雜、性能不穩(wěn)定，因此，展示的效率可能不高；另外，由于展示的過程復(fù)雜，成本高，限制了有機磷水解酶表面展示的大規(guī)模應(yīng)用。今后，表面展示系統(tǒng)的開發(fā)將會是表面展示技術(shù)研究的重點。

參考文獻：

[1]全爽，李曄，金麗華，等.有機磷水解酶及其在傳感器應(yīng)用中的研究進展[J].生態(tài)學(xué)，2015，34（1）：198?204.

[2]Sang Yup Lee， Jong Hyun Choi1， Zhaohui Xu. Microbial cell-surface display[J]. TRENDS in Biotechnology， 2003， 21（1）： 45-52.

[3]廖上鐵，黎小軍.有機磷水解酶及其細(xì)胞表面展示研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：2165-2167.

[4]Takeshi Fukuda， Kouta Tsuchiyama， Hirokazu Makishima， et al. Improvement in organophosphorus hydrolase activity of cell surface-engineered yeast strain using Flo1p anchor system[J]. Biotechnol Lett， 2010（32）： 655-659.

[5]Xing-Xing Wang， Zhe Chi， Shao-Guo Ru， et al. Genetic surface-display of methyl parathion hydrolase on Yarrowia lipolytica for removal of methyl parathion in water[J]. Biodegradation， 2012（23）： 763-774.

[6]張紅星，李茜茜，葉婷，等.細(xì)胞表面展示有機磷水解酶的惡臭假單胞菌的構(gòu)建及全細(xì)胞酶活性分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，27（1）：65-70.

[7]Yulan Yuan， Chao Yang， Cunjiang Song， et al. Anchorage of GFP fusion on the cell surface of Pseudomonas putida[J]. Biodegradation， 2012（22）： 51-61.

（責(zé)任編輯：丁志祥）