劉佳麗王維王子萌范芳梅馬毓蓉余林何於娟

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（重慶400016）2重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶400016）3重慶市第六人民醫(yī)院（重慶400080）

·基礎(chǔ)研究·

小鼠急性未分型流感嗜血桿菌中耳炎差異基因的互作網(wǎng)絡(luò)特征分析

劉佳麗1王維2，3王子萌2范芳梅2馬毓蓉2余林1何於娟2

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（重慶400016）2重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶400016）3重慶市第六人民醫(yī)院（重慶400080）

目的利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）查找小鼠中耳炎表達(dá)譜基因芯片原始數(shù)據(jù)，建立中耳炎基因互作網(wǎng)絡(luò)圖。方法從公共數(shù)據(jù)庫GEO中下載小鼠中耳炎相關(guān)數(shù)據(jù)集，采用Affymetrix Expression Console軟件和Tran?scriptome Analysis Console（TAC）軟件篩選差異表達(dá)基因，將差異基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，繪制差異基因互作網(wǎng)絡(luò)圖，并將互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件中，篩選網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)，并取其中相對(duì)獨(dú)立、作用較為集中且與炎癥基因相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)，采用David在線工具對(duì)其進(jìn)行功能注釋富集分析。結(jié)果共篩選出1166個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)793個(gè)，表達(dá)下調(diào)373個(gè)，經(jīng)STRING在線工具篩選后共有459個(gè)小鼠中耳炎差異基因編碼的蛋白存在相互作用，并得到相應(yīng)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分析其中與炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建了中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡(luò)，其中的網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)基因，對(duì)于中耳炎分子機(jī)制研究及靶向治療具有指導(dǎo)作用。

未分型流感嗜血桿菌；中耳炎；基因芯片；互作網(wǎng)絡(luò)

Funding:This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(csfc81373151),supported by the National Natural Science Foundation of China（cstc2012jjA10014）,supported by the Project Foundation of Chongqing Municipal Education Committee（KJ130313）,supported by National Key Clinical Specialties Construction Program of china.

Declaration of interest:The authors report no conflict of interest．

中耳炎（Otitis media,OM）是兒童時(shí)期最常見的感染性疾病之一[1]。在歐美國家，3歲以下兒童發(fā)病率高達(dá)80%[2,3]。大部分兒童在一般治療后痊愈，少數(shù)患兒發(fā)展為復(fù)發(fā)性或慢性中耳炎（Chronic otitis media），表現(xiàn)為中耳炎反復(fù)發(fā)作或遷延不愈，嚴(yán)重時(shí)造成進(jìn)行性聽力下降，影響患兒生活質(zhì)量[4,5,6]。但至今其機(jī)制仍不十分明確。已有研究證實(shí)中耳炎期間有大量的基因參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如Fbxo11或者Evil基因缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠自發(fā)性中耳炎的發(fā)生[7,8]，TNF-ɑ、IL-6、IL-1等炎癥基因以及Toll樣受體也參與了中耳炎的發(fā)生[9,10]。目前GEO數(shù)據(jù)庫已有關(guān)于中耳炎小鼠的基因芯片研究，經(jīng)生物信息學(xué)分析后篩選出大量差異基因[9]。為進(jìn)一步了解這些基因產(chǎn)物之間的相互作用及其在中耳炎發(fā)生中的作用，我們采用生物信息學(xué)方法繪制出差異基因互作網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出其主要網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)，將有助于拓展中耳炎致病機(jī)制的研究思路，并為中耳炎治療提供指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1材料

本研究所用數(shù)據(jù)是小鼠急性中耳炎基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GSE66141），來源于美國國立生物信息中心（National Center for Biotechnology Informa?tion,NCBI）基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omni?bus,GEO），在GEO數(shù)據(jù)庫中以O(shè)titis Media為檢索詞進(jìn)行搜索，獲得Nick Webster提交的GSE66141芯片數(shù)據(jù)。本研究中芯片數(shù)據(jù)采用Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array平臺(tái)，并且文章中所用芯片數(shù)據(jù)共包含30個(gè)樣本（包含6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、以及未處理組均生物學(xué)重復(fù)兩次，小鼠第1天炎癥基因表達(dá)達(dá)到最高峰）[11]。本研究中小鼠急性中耳炎模型所用細(xì)菌為未分型流感嗜血桿菌，此細(xì)菌是急性中耳炎最常見的致病菌之一。

1.2方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析采用Affymetrix Expression Console software和Transcriptome Analy? sis Console（http://www.affymetrix.com/estore/index. jsp）對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將GSE66141原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Affymetrix Expression Console軟件，采用單因素方差分析（one-way Between-Subject ANO?VA），將樣本數(shù)據(jù)（GSE66141芯片數(shù)據(jù)取第1天時(shí)間點(diǎn)）按照中耳炎組、生理鹽水組進(jìn)行差異比較，對(duì)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行有效過濾，從而篩選差異基因，篩選條件為：Fold Change＜-2 or Fold Change＞2,P＜0.05。

1.2.2中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡(luò)分析STRING蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫能通過基因間的基因組相關(guān)性來預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，是目前最大的且應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫之一。將篩選出的1166個(gè)中耳炎差異基因（上調(diào)基因793個(gè)，下調(diào)基因373個(gè)）導(dǎo)入STRING（http://string-db.org）生物信息在線工具，分析差異基因所編碼蛋白之間相互作用，并在線繪制差異基因所編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 挖掘互作網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)Cytoscape軟件是一個(gè)開放源碼的生物信息分析軟件，可用于構(gòu)建可視化的分子交互作用網(wǎng)絡(luò)，并可將已有基因表達(dá)信息整合進(jìn)此網(wǎng)絡(luò)中，觀察分子之間如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的關(guān)聯(lián)性。將上述STRING在線工具所分析差異基因互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件，進(jìn)一步對(duì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，尋找網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)，并選取其中相對(duì)獨(dú)立、作用較為集中且與炎癥相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)繪圖，同時(shí)將子網(wǎng)絡(luò)所包含蛋白在pubmed中進(jìn)行文獻(xiàn)檢索來驗(yàn)證分析中耳炎發(fā)展過程中可能涉及的分子基礎(chǔ)。

1.2.4 炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)功能注釋富集分析和通路分析DAVID生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫可為大量基因或蛋白提供詳細(xì)的生物學(xué)注釋信息。將所篩選炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)所涉及基因上傳DAVID（https://da?vid.ncifcrf.gov/）在線分析軟件，對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO功能注釋富集分析以及生物學(xué)信號(hào)通路和京都基因與基因組百科全書分析，以便闡述子網(wǎng)絡(luò)中基因所包含生物學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡(luò)將從GEO數(shù)據(jù)庫獲取的中耳炎基因芯片原始數(shù)據(jù)用生物信息

學(xué)方法分析后得到1166個(gè)差異基因，經(jīng)STRING在線工具分析蛋白網(wǎng)絡(luò)后，共有459個(gè)基因編碼蛋白存在相互作用，并構(gòu)成復(fù)雜基因互作網(wǎng)絡(luò)（圖1），并且由圖可以觀察到網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)不僅與周邊節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用，還與其他中心節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用。

圖1 急性中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Interaction network of the diffetentially expressed genes in acute otitis media

2.2炎癥相關(guān)蛋白互作子網(wǎng)絡(luò)經(jīng)Cytoscape對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，并選取相互作用較為集中且與炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，選取子網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)蛋白在pubmed中進(jìn)行文獻(xiàn)檢索驗(yàn)證后，得到以fpr1（甲酰肽受體1）、cxcr2（趨化因子C-X-C基序受體2）、Irg1（炎癥反應(yīng)基因1）、cxcl5（趨化因子C-X-C基序配體）等為重要節(jié)點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)（圖2），其中包含40個(gè)表達(dá)異常的蛋白質(zhì)（表1）。

圖2 急性中耳炎炎癥相關(guān)蛋白互作子網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Interaction subnetwork of inflammation-related protein in acute otitis media

表1 中耳炎炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)涉及基因及其在基因芯片中差異倍數(shù)Table.1 The genes in infalmmation-related interaction subnetwork and their fold changes by microarray

2.3 子網(wǎng)絡(luò)功能注釋富集分析將上述子網(wǎng)絡(luò)涉及基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID在線分析工具，并對(duì)GO分類p值取0.05過濾后發(fā)現(xiàn)，子網(wǎng)絡(luò)共涉及16種GO生物學(xué)過程（biological process，BP）分類（表2），這些基因主要參與炎癥應(yīng)答、創(chuàng)傷反應(yīng)、趨化、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程。

表2 子網(wǎng)絡(luò)功能注釋富集分析（生物學(xué)過程）Table.2 The function annotation of the interaction subnetwork(biological process)

3 討論

中耳炎是兒童時(shí)期最常見的感染性疾病之一，多種基因均參與其發(fā)病過程。但目前對(duì)中耳炎研究主要傾向于傳統(tǒng)單基因方面，顯然已不能滿足當(dāng)前系統(tǒng)生物學(xué)研究的需要。而對(duì)中耳炎采用高通量表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)分析后將獲得大量關(guān)于中耳炎數(shù)據(jù)信息，包含大量差異表達(dá)基因，此時(shí)采用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，篩選在中耳炎發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用的基因，對(duì)于后續(xù)中耳炎研究方向的拓展，以及對(duì)闡述中耳炎發(fā)生的分子機(jī)制具有重要作用。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫獲得小鼠中耳炎高通量表達(dá)譜芯片原始數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘篩選后發(fā)現(xiàn)有459個(gè)差異基因所編碼蛋白存在相互作用，其中與炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)包含40種異常表達(dá)蛋白質(zhì)，并廣泛參與炎癥相關(guān)的多種生物學(xué)過程。其中在中耳炎中差異顯著的三個(gè)基因cxcl5、fpr1、Irg1在炎癥進(jìn)程中均發(fā)揮著重要作用。提示中耳炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中涉及多種基因的相互作用。

cxcl5基因編碼趨化因子C-X-C基序配體5，是一種來源于上皮細(xì)胞的中性粒細(xì)胞活化肽，由致炎因子刺激產(chǎn)生，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附活性，能在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥中誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[12,13]。目前已有研究證實(shí)cxcl5在流感嗜血桿菌誘導(dǎo)的中耳炎小鼠中耳中表達(dá)上調(diào)，并且流感嗜血桿菌通過調(diào)節(jié)NF-kB的核轉(zhuǎn)運(yùn)來激活I(lǐng)kkβ和p38 MAPK信號(hào)通路，從而使cxcl5在中耳上皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào)[14]，表明cxcl5確實(shí)在中耳炎發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。在本研究構(gòu)建的炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)中，我們發(fā)現(xiàn)cxcl5基因與saa3、ccl6、ccl28、cxcl3、cx?cr2、fpr1、p2ry13、gpr18、cnr1、cnr2、kng1、ppbp基因存在相互作用，并經(jīng)趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體信號(hào)通路等參與小鼠中耳炎的發(fā)生。

fpr1編碼甲酰肽受體1，是一種趨化炎癥細(xì)胞的功能受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在炎癥刺激下能促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的清除[15,16]。研究顯示fpr1可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化、產(chǎn)生活性氧、脫顆粒、表達(dá)細(xì)胞因子并誘導(dǎo)吞噬作用、改變細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)[17]。在肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠模型中fpr1的缺乏將導(dǎo)致小鼠炎癥加重并增加患病小鼠的死亡率[18]。芯片結(jié)果顯示fpr1在小鼠中耳炎中呈高表達(dá)，提示fpr1可能參與了中耳炎的發(fā)病過程。在本研究的子網(wǎng)絡(luò)中，fpr1基因與cxcl5、cx?cl3、ccl6、ccl28、cxcr2、cnr1、cnr2、ppbp、kng1、p2ry13、Igsf6、pilra基因存在相互作用，并經(jīng)趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體信號(hào)通路參與小鼠中耳炎發(fā)生。

Irg1編碼免疫應(yīng)答基因1，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是重要的免疫調(diào)控因子，脂多糖可誘導(dǎo)其產(chǎn)生，并通過酪氨酸激酶磷酸化及PKC激酶途徑發(fā)揮作用。有研究證實(shí)Irg1的存在可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，通過抑制Irg1的轉(zhuǎn)錄后可在細(xì)菌感染過程中通過降低衣康酸在巨噬細(xì)胞的水平來降低其抗菌活性[19]。有研究發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子后，可減輕小鼠急性中耳炎炎癥，并改善小鼠聽力[20]，表明巨噬細(xì)胞的功能可能與中耳炎病程相關(guān)。因此，Irg1作為巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物，并參與調(diào)節(jié)其吞噬活性，我們推測(cè)其可能參與了中耳炎疾病進(jìn)程，值得進(jìn)一步深入研究。本研究構(gòu)建的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中，Irg1基因與saa3、clec5a、rnf149、marcks1、gpr84、nfkbiz、ccrl2、cxcl3、slc15a3基因存在相互作用，經(jīng)趨化因子信號(hào)通路，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子信號(hào)通路參與小鼠中耳炎發(fā)病過程。

綜上，我們認(rèn)為中耳炎的發(fā)生是涉及多種基因水平變化并相互作用的一個(gè)復(fù)雜過程，并構(gòu)成了復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)，其中與炎癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)主要涉及cx?cl5、fpr1、Irg1等基因的作用，并廣泛參與如炎癥應(yīng)答、趨化、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路等多種炎癥相關(guān)生物學(xué)進(jìn)程。本研究獲得的中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡(luò)圖不僅為中耳炎研究方向的擴(kuò)展提供新思路，對(duì)于中耳炎發(fā)病機(jī)制的闡述以及分子靶向治療的研究也具有較好的提示作用。

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Interaction network analysis of differentially expressed genes in mice with unclassified haemophilus influenzae induced otitis media

Liu Jiali1,Wang Wei2,3,Wang Zimeng2,Jin Chunfang2,Fan Fangmei2,Ma Yurong2,Yu Lin1,He Yujuan2
1 Department of Otorhinolaryngology,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016 2 College of Laboratory Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China 3 College The Sxith People’s Hospital of Chongqing City,Chongqing 400080,China Corresponding author:He Yujuan Email:yjhemail@126.com

Objective Using bioinformatics methods to analyze gene expression microarray of otitis media in order to establish a protein interaction network.Methods The microarray data sets of otitis media from the mouse were downloaded from the public gene expression database Gene Expression Ombibus(GEO).The differentially expressed genes were screened by Affymetrix Expression Console software and Transcriptome Analysis Console(TAC)software.Then the differentially expressed genes were introduced into the STRING online database for analysis,and the interaction network was established.The interaction data was subsequently introduced into the Cytoscape 3.4.0 software,and the network center nodes were screened,and those relatively independent sub-networks associated with the inflammation genes were selected.David online tools were used for functional annotation enrichment analysis of these sub-networks. Results A total of 1166 differentially expressed genes were screened out,including 793 up-regulated and 373 down-regulated.Screened by STRING,interactions of protein products from 459 differentially expressed genes were found,andthe corresponding protein interaction network was obtained.Conclusion In this study,bioinformatics techniques were used to construct the interaction network of the differentially expressed genes for otitis media.The network,especially the center node gene could provide new clues of the molecular mechanism of otitis media,and guide the targeted therapy.

Nontypeable Haemophilus influenzae;Otitis media;Microarray;Interaction network

R764.21

A

1672-2922（2017）01-94-5

2016-09-05審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.018

國家自然科學(xué)基金（csfc81373151）、重慶市自然科學(xué)基金（cstc2012jjA10014）、重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ130313）、國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)基金資助衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號(hào)

劉佳麗，碩士，研究方向:中耳炎發(fā)病機(jī)制

何於娟，Email:yjhemail@126.com