朱靜靜,王 楠,沈佳盈,鄭星霞,金巧燕,張 慧

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015)

甲魚(yú)抗氧化肽的超濾分離研究

朱靜靜,王 楠*,沈佳盈,鄭星霞,金巧燕,張 慧

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015)

以甲魚(yú)為原料,利用中性蛋白酶制備甲魚(yú)蛋白酶解肽,以膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別研究操作壓力、操作溫度、料液濃度對(duì)超濾效果的影響。確定了較適宜的超濾條件為:操作壓力30 psi,操作溫度25 ℃,料液濃度15 g/L。采用分子質(zhì)量為 5 ku超濾膜分離甲魚(yú)蛋白酶解肽能夠顯著提高其DPPH·清除率、還原力、總抗氧化活性,并且其抗氧化活性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。結(jié)論：分子量<5 ku的甲魚(yú)蛋白肽段具有較高的抗氧化活性。

甲魚(yú)蛋白酶解肽,超濾,DPPH·清除率,還原力,總抗氧化活性

生物活性肽(Bioactive Peptides)是具有生理功能的特殊蛋白片段[1]。1960年,Marcuse[2]首先在《Nature》上報(bào)道了食源氨基酸的抗氧化活性。食源性抗氧化肽(Antioxidative Peptides)由于其分子量小、成本低、活性強(qiáng)、易吸收、穩(wěn)定性強(qiáng),具有抑制、延緩脂質(zhì)氧化,保護(hù)人體組織器官免受自由基侵害的作用,已成為一種健康、安全的抗氧化劑[3],也將會(huì)成為控制人體機(jī)體內(nèi)各種氧化過(guò)程的潛在能源。已有研究[3-5]從大豆、羊棲菜、鷹嘴豆、玉米、酪蛋白、乳清、蛋、貽貝、魚(yú)、泥鰍和蝦等多種動(dòng)植物蛋白中制備抗氧化肽。近年來(lái),抗氧化肽已成為國(guó)內(nèi)外研究最多的生物活性肽之一。

甲魚(yú)又稱鱉、團(tuán)魚(yú)、腳魚(yú)、水魚(yú),動(dòng)物界,脊索動(dòng)物門,脊椎動(dòng)物亞門,爬行綱,龜鱉目,鱉科,鱉屬,是一種水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[6]。甲魚(yú)蛋白含量較高,甲魚(yú)為冷血?jiǎng)游?經(jīng)過(guò)規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖,其蛋白的安全性較高,可以作為制備高品質(zhì)活性肽的優(yōu)質(zhì)原料[7]。前期研究表明,甲魚(yú)蛋白酶解液中具有潛在的抗氧化生物活性肽段[6],但是在利用蛋白酶水解制備活性肽過(guò)程中,酶解液中常存在一些未水解和未水解完全的大分子蛋白質(zhì)和酶,采用分離純化的手段可以提高其生物活性。超濾分離是按照膜截留的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)物料進(jìn)行分離[8],以壓差為推動(dòng)力,利用高分子薄膜憑借各組分在膜中傳質(zhì)的選擇性差異對(duì)多肽進(jìn)行分離和濃縮[9]。因此,本研究采用超濾可以實(shí)現(xiàn)甲魚(yú)抗氧化肽的分離和濃縮,有效提高甲魚(yú)蛋白酶解肽的抗氧化活性,從而有利于實(shí)現(xiàn)抗氧化肽產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化。

膜通量是膜分離過(guò)程的一個(gè)重要工藝運(yùn)行參數(shù),是指單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位膜面積上的流體量。本實(shí)驗(yàn)以膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化了超濾過(guò)程中操作壓力、操作溫度、料液濃度等超濾條件,并比較了超濾對(duì)甲魚(yú)蛋白肽的抗氧化作用的影響,從而為甲魚(yú)抗氧化肽制備的產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲魚(yú) 浙江市售;中性蛋白酶(100 U/mg)上海源葉生物科技有限公司;L-酪氨酸 上?？到萆锟萍及l(fā)展有限公司;DPPH試劑盒 南京建成生物工程研究所;其它試劑均為分析純。

Millipore-Labscale超濾設(shè)備 Millipore杯式超濾器,5 ku膜包 美國(guó)Millipore公司;PHS-3C pH計(jì) 杭州奧立龍儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;UV-124型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津有限公司;PL303型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FD-1D-50型冷凍干燥機(jī) 北京醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Biofuge Prino R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)賀利氏公司;Waters 2695-2996 高效液相色譜儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甲魚(yú)肽的制備 甲魚(yú)宰殺→去脂→脫殼→打漿→凍干→蛋白酶酶解8 h,連續(xù)攪拌,每30 min用0.5 mol/L的NaOH 或0.5 mol/L 的HCl調(diào)節(jié)一次pH使其保持在7.0→滅酶(煮沸10～15 min)→離心抽濾(4000 r/min,10 min)→取上清液→冷凍干燥→保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2 甲魚(yú)抗氧化肽的超濾分級(jí)分離 在 0.25 MPa壓力下超濾,依次用透過(guò)分子質(zhì)量為5,3 ku的超濾膜超濾分別得到分子質(zhì)量為>5,3～5,<3 ku 的甲魚(yú)蛋白酶解肽濾出液,凍干后稱重。

1.2.3 甲魚(yú)抗氧化肽的超濾分離條件優(yōu)化 配制不同濃度的甲魚(yú)蛋白酶解液,首先采用0.45 μm的中空纖維膜對(duì)甲魚(yú)蛋白酶解液進(jìn)行微濾。微濾所得濾液用5 ku的超濾膜進(jìn)行超濾分離,在超濾過(guò)程中,以膜通量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),分別考察操作壓力(10、20、30 psi)、樣品濃度(5、10、15、20 g/L)和操作溫度(15、20、25、30、35 ℃)等超濾條件對(duì)超濾分離的影響。

1.3 分析方法

1.3.1 膜通量的計(jì)算 超濾過(guò)程中的特性指標(biāo)主要是膜通量,即單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位膜面積的透過(guò)液的量來(lái)表示[10-11]。膜通量的計(jì)算:

式(1)

式(1)中:J:膜通量,(L/m2h);V:透過(guò)液的體積,(L);A:膜的面積,(m2);T:超濾所用的時(shí)間,(min)。

1.3.2 抗氧化活性的評(píng)價(jià)

1.3.2.1 DPPH·清除能力的測(cè)定 取0.1 mL蛋白酶解液,加入1×10-4mol/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液2.8 mL,混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min,并在4000 r/min下離心10 min,取上清液用分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)定其吸光度Ai,空白組以等體積無(wú)水乙醇溶液代替DPPH·溶液,并以等體積蒸餾水和無(wú)水乙醇混合液空白調(diào)零[12-13]。清除率按下式計(jì)算:

式(2)

式(2)中:Ai:樣品組吸光度;A:空白組吸光度。

1.3.2.2 還原力測(cè)定 參考Kaur等的方法[14],取1.0 mL(0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL)酶解液與(0.2 mol/L,pH為6.6)的磷酸緩沖液和2.5 mL的1%鐵氰化鉀均勻混合,置于50 ℃孵化20 min,然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸,3000 r/min離心力,離心10 min取上清液2.5 mL,加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL(0.1%)的氯化鐵。在700 nm下測(cè)定吸光度,增加的吸光度表示增加還原能力。BHT(二叔丁基對(duì)甲酚)作為陽(yáng)性對(duì)照。吸光值越大表示還原能力越強(qiáng)[15]。

1.3.2.3 總抗氧化活性 參考高燕等的方法[16],取0.1 mL的酶解液(0.25、0.50、0.75、1.0 mg/mL)加入到1 mL EP管中加入1 mL溶解試劑(0.6 mmol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉、4 mmol/L鉬酸銨)。EP管在90 ℃孵化90 min,冷卻后在695 nm下測(cè)定吸光度。對(duì)照組1 mL溶解試劑(0.6 mmol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉、4 mmol/L鉬酸銨)加0.1 mL蒸餾水。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾后各級(jí)組分含量的比較

由表1可看出,甲魚(yú)蛋白酶解肽分級(jí)超濾后稱重,<3 ku的甲魚(yú)蛋白酶解肽僅僅占16%,3～5 ku甲魚(yú)蛋白酶解肽占55%?？紤]樣品得率因素,本實(shí)驗(yàn)采用5 ku的超濾膜進(jìn)行超濾分離研究。

表1 甲魚(yú)蛋白酶解肽超濾后各級(jí)組分含量的比較Table 1 Comparison of content of Turtle protein hydrolysis peptides various component by ultrafiltration

2.2 超濾工藝參數(shù)對(duì)膜通量的影響

2.2.1 操作壓力對(duì)膜通量的影響 利用超濾分離蛋白肽時(shí),操作壓力對(duì)超濾效率的影響主要在于膜污染,即物料中的微粒、膠體離子或溶質(zhì)大分子在膜表面或膜孔內(nèi)吸附、沉積造成膜孔徑變小或堵塞,使膜通量及膜的分離特性產(chǎn)生不可逆變化[17]。當(dāng)樣品濃度(15 g/L)和超濾溫度(25 ℃)在一定的條件下,優(yōu)化合適的操作壓力,以避免膜污染,有效保證超濾效率,從而延長(zhǎng)超濾膜的使用周期。

由圖1可以看出,在同一操作壓力的條件下,膜通量隨著超濾時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。最初,膜通量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速下降,但隨著超濾時(shí)間的延長(zhǎng),膜通量的變化逐漸變緩。超濾壓力在10 psi到30 psi范圍內(nèi),初始膜通量隨著操作壓力的增加而迅速提高,在膜過(guò)濾10 min時(shí),超濾壓力為10、20、30 psi的膜通量分別為12.02、21.69、28.7 L/m2h。主要是由于超濾壓力越大,膜兩側(cè)的壓力差則越大,膜通量也越大。在同一操作壓力處理?xiàng)l件下,前40 min內(nèi),膜通量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降,40 min后,膜通量的變化趨于平穩(wěn)。主要是由于隨著超濾時(shí)間的延長(zhǎng)膜表面會(huì)產(chǎn)生凝膠層,而增大傳質(zhì)阻力,導(dǎo)致較低的操作效率。綜合考慮以上各個(gè)因素,本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的操作壓力為30 psi。

圖1 操作壓力對(duì)膜通量的影響Fig.1 Effect of operating pressure on membrane flux

2.2.2 操作溫度對(duì)膜通量的影響 在其它超濾條件不變的情況下,探究超濾操作溫度對(duì)甲魚(yú)肽分離膜通量的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 操作溫度對(duì)膜通量的影響Fig.2 Effect of operating temperature on membrane flux

由圖2可以看出,在超濾過(guò)程中,隨著操作溫度的升高,膜通量逐漸增加。在超濾處理10 min時(shí),操作溫度為15、20、25、30、35 ℃樣品的膜通量分別為31.20、35.41、40.20、43.20、44.40 L/m2h,結(jié)果表明,操作溫度為15～25 ℃時(shí),膜通量上升幅度較大,分別為4.21、4.79 L/m2h,但隨著操作溫度進(jìn)一步上升,膜通量上升的幅度逐漸減小,操作溫度在25～35 ℃范圍內(nèi),膜通量上升幅度分別為3.00、1.20 L/m2h。主要是由于隨著操作溫度的升高,料液黏度下降,擴(kuò)散系數(shù)增加,進(jìn)而減少了濃差極化的影響[18]。在同一操作溫度處理?xiàng)l件下,前40 min內(nèi),膜通量隨著時(shí)間的推移明顯下降,40 min之后,膜通量的變化趨于平穩(wěn)。然而,隨溫度升高蛋白質(zhì)大分子在膜表面的吸附會(huì)增加,且容易被微生物污染,從而降低膜通量的增幅。在實(shí)際操作過(guò)程中,綜合考慮超濾效率、防止微生物生長(zhǎng)所致的膜污染及節(jié)省能源等因素,選擇25 ℃較為適宜。

2.2.3 料液濃度對(duì)膜通量的影響 在其它超濾條件不變的情況下,研究料液濃度對(duì)甲魚(yú)肽超濾分離的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 料液濃度對(duì)膜通量的影響Fig.3 Effect of liquor concentration on membrane flux

由圖3可知,在其它超濾條件相同的情況下,料液濃度越低,膜通量越大。隨著分離時(shí)間的延長(zhǎng),膜通量顯著下降,但隨著時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),膜通量沒(méi)有顯著的變化。分別對(duì)料液濃度為5、10、15、20 g/L的樣品進(jìn)行超濾,在10 min時(shí),膜通量分別為43.2、35.64、31.2、26.4 L/m2h。這是由于在較低的料液濃度時(shí),液體在膜管內(nèi)的流動(dòng)趨于湍流狀態(tài),且大分子溶質(zhì)不易堆積,可以保持較高的膜通量[11]。但料液比為5、10 g/L時(shí),由于濃度過(guò)低,僅僅是溶劑(水)通量的提高,而溶質(zhì)(小肽及其他小分子物質(zhì))通量反而下降,使膜效能下降[19]。適當(dāng)?shù)奶岣吡弦簼舛?有利于提高超濾效率,充分發(fā)揮超濾膜的作用。綜合膜通量和超濾效率兩方面考慮,采用15 g/L的甲魚(yú)蛋白酶解液料液濃度進(jìn)行分離。

2.3 超濾前后所得樣品的抗氧化活性比較

2.3.1 超濾前后所得樣品的DPPH·清除率的比較 DPPH·是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的自由基,被廣泛用作抗氧化成分的體外抗氧化性評(píng)價(jià)有物質(zhì)。分別對(duì)5 ku超濾膜處理前后的肽樣品的DPPH·清除率進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知,肽濃度為0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL時(shí),隨著肽濃度的增加,超濾前后所得樣品的DPPH·清除率都呈上升趨勢(shì),但是超濾后的樣品遞增趨勢(shì)比超濾前樣品的遞增趨勢(shì)更大。當(dāng)肽濃度為1 mg/mL時(shí),超濾前后樣品的DPPH·清除率分別為24.48%和32.94%。結(jié)果表明,分子量低于5 ku的甲魚(yú)蛋白酶解肽樣品的DPPH·清除率更好,超濾可以顯著提高甲魚(yú)肽的DPPH·清除率。

圖4 超濾前后所得樣品的DPPH·清除率比較Fig.4 The comparison of DPPH· radical scavenging capabilities of samples注:不同字母代表同一濃度下,超濾前后所得樣品的DPPH·清除率的差異顯著性(p<0.05),圖5、圖6同。

2.3.2 超濾前后所得樣品的還原力的比較 研究表明,生物活性物的抗氧化活性與其還原力具有直接關(guān)系,還原力可以用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化物提供氫原子或者提供電子的能力[20-21],根據(jù)1.4.2.2所述還原力的測(cè)定方法,分別對(duì)5 ku超濾膜分離得到的超濾前后樣品的還原力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知,隨著肽濃度的增加,超濾前后樣品的還原力均呈上升趨勢(shì),超濾后樣品的遞增趨勢(shì)比超濾前樣品的遞增趨勢(shì)更大。在肽濃度分別為0.25 mg/mL時(shí),超濾前后樣品的還原力沒(méi)有顯著差異,隨著肽濃度的增加,超濾后樣品的還原力顯著高于超濾前的樣品,說(shuō)明超濾后樣品的還原力高于超濾前樣品的還原力。結(jié)果表明超濾后可以顯著提高甲魚(yú)肽的還原力。

圖5 超濾前后所得樣品的還原力的比較Fig.5 The comparison of reducing power of samples

2.3.3 超濾前后所得樣品的總抗氧化活性的比較 根據(jù)1.4.2.3所述的總抗氧化活性測(cè)定方法,分別對(duì)5 ku超濾膜分離得到的超濾前后樣品的總抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知,在肽濃度為0.25～1 mg/mL范圍內(nèi),隨著肽濃度的增加,超濾前后樣品的總抗氧化活性均呈上升趨勢(shì),超濾后樣品的遞增趨勢(shì)比超濾前樣品的遞增趨勢(shì)更大。結(jié)果說(shuō)明,超濾后可以顯著提高甲魚(yú)肽的總抗氧化活性。

圖6 超濾前后所得樣品的總抗氧化活性的比較Fig.6 The comparison of the total antioxidant activities of samples

據(jù)報(bào)道,小于20個(gè)氨基酸殘基的抗氧化肽,分子越低其穿過(guò)腸道屏障發(fā)揮生物效應(yīng)的機(jī)率越高[22]。有研究表明,活性肽的生物活性與分子量相關(guān)[23-24]。林慧敏[25]等研究表明,利用3 ku的超濾膜分離帶魚(yú)蛋白亞鐵螯合肽,可以顯著提高其抗氧化活性。彭維兵[26]等研究發(fā)現(xiàn),分子量在1 ku以下的花生肽,對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化具有較好的抑制作用,呈現(xiàn)劑量依賴性的抗氧化活性。李桂峰[27]利用木瓜蛋白酶酶解雙孢菇蛋白制備了抗氧化肽,其相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在 600～2600 ku。本研究超濾前后所得樣品的抗氧化活性比較研究表明,分子量低于5 ku的甲魚(yú)蛋白酶解肽的抗氧化活性較高,這些結(jié)果表明5 ku超濾膜分離可有效提高甲魚(yú)蛋白酶解肽的抗氧化活性,高活性抗氧化肽主要分布在<5 ku的分子量肽段,說(shuō)明低分子量肽產(chǎn)物的抗氧化活性較高。

3 結(jié)論

本研究確定了采用5 ku膜超濾分離甲魚(yú)蛋白酶解肽的最佳條件為:操作壓力為30 psi,操作溫度為25 ℃,料液濃度為15 g/L。結(jié)果表明,采用5 ku超濾膜分離可有效提高甲魚(yú)蛋白酶解肽的DPPH·清除率、還原力、總抗氧化活性抗氧化活性,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,分子量<5 ku的甲魚(yú)蛋白酶解肽段具有較高的抗氧化活性。

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Study on the separation of antioxidant peptides from Turtle using ultrafiltration

ZHU Jing-jing,WANG Nan*,SHEN Jia-ying,ZHENG Xing-xia,JIN Qiao-yan,ZHANG Hui

(College of Biology and Environmental Engineering,Zhejiang Shuren University,Hangzhou 310015,China)

Turtle protein hydrolysis peptides were prepared using Turtle as raw material. Based on the membrane flux,the effects of pressure,temperature and concentration on ultrafiltration treatment efficacy were studied. The results showed that the optimum conditions of ultrafiltration treatment were pressure of 30 psi,temperature of 25 ℃,and concentration of 15 g/L. The permeate fractions of 5 ku membrane can significantly increase the Turtle protease peptide DPPH· clearance,reducing power,total antioxidant activity,and its antioxidant activity present concentration-response relationship. Conclusion:the molecular neight below 5 ku of turtle protein hydrolysis peptides with high antioxidant activities.

Turtle protein hydrolysis peptides;ultrafiltration;DPPH scavenging activity;reducing power;total antioxidant activity

2016-08-19

朱靜靜(1995-)，女，本科，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:578271240@qq.com。

*通訊作者:王楠(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:xiaofeiyu0708@163.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31401500);浙江省自然科學(xué)基金(Y17C200037);浙江省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(LQ13C200005);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201511842005);浙江樹(shù)人大學(xué)中青年術(shù)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助。

TS201

A

1002-0306(2017)07-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.011