歐云文,馬小元,王 俊,丁耀忠,張永光,張 杰*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046)

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研究論文

豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達及反應原性分析

歐云文1,2,馬小元2,王 俊2,丁耀忠2,張永光2,張 杰2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046)

研究豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性，為開發(fā)PCV2的檢測方法奠定基礎(chǔ)。以PCV2 CAU0673毒株的DNA為模板，擴增獲得702 bp的目的片段，擴增產(chǎn)物克隆入pET30a(+)原核表達載體，構(gòu)建pET30a-PCV2-ORF2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)；在37 ℃以1 mmol/L IPTG誘導表達6 h；采用Ni-NTA樹脂親和層析純化重組蛋白，并用不同濃度的尿素對純化蛋白進行復性。SDS-PAGE分析表明，該ORF2編碼基因在大腸埃希菌中得到表達，蛋白大小約為34 ku；Western blot檢測結(jié)果表明，該重組Cap蛋白與PCV2陽性血清發(fā)生特異性反應，與NA-PRRSV和PPV1血清不發(fā)生交叉反應。成功構(gòu)建了PCV2-ORF2原核表達載體，實現(xiàn)了在大腸埃希菌中的表達，純化后的復性蛋白具有較好的反應原性，為豬圓環(huán)病毒2型檢測方法建立或試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型；ORF2基因；原核表達；反應原性

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是無囊膜的、環(huán)狀、單股負鏈DNA病毒，為目前已知最小的動物病毒；豬感染該病毒后，導致其免疫機能及生產(chǎn)機能下降，常表現(xiàn)消瘦、黃疸、呼吸急促、咳喘等臨床癥狀，是嚴重影響國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一[1]。豬圓環(huán)病毒分為兩個基因型，即豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。1974年，Tischer I等[2]首次從PK-15細胞系中分離出PCV1，長期研究表明,該病毒無明顯致病性，廣泛存在于正常豬體內(nèi)的多個組織器官之中[3-4]；PCV2于1991年在加拿大首次被分離，該病毒可導致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，PCV2是豬圓環(huán)病毒家族中非常重要的成員，也是豬群中最常見的豬圓環(huán)病毒型[5]。與此同時，PCV2常和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)等繁殖障礙性病毒混合感染而導致豬只發(fā)病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[6-9]。因而，加強PCV2的研究，對有效預防和控制豬圓環(huán)病毒2型有著重要意義。

PCV2是環(huán)狀、單股負鏈DNA病毒，基因組大小為1 768 bp，病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，病毒基因組包含有11個開放閱讀框(open reading frame，ORF)[10]。其中ORF1主要編碼Rep蛋白，該蛋白是病毒復制過程中必需的非結(jié)構(gòu)蛋白[11]；ORF3基因位于ORF1區(qū)域之內(nèi)，但是與ORF1的轉(zhuǎn)錄方向相反，ORF3編碼一種病毒復制所非必需的非結(jié)構(gòu)蛋白，但是其可以誘導宿主細胞的凋亡[12-13]；ORF4位于ORF3基因的內(nèi)部，編碼方向與ORF3相同，其也不是病毒復制所必需的[14]；ORF5、ORF7、ORF10與ORF1在5′-3′方向相同，位于病毒基因組的負鏈上，ORF6、ORF8、ORF9、ORF11 與ORF2、ORF3、ORF4在5′-3′方向相同，位于病毒基因組互補鏈上，并且這些閱讀框互相重疊，使PCV2的遺傳信息得到充分表達[10]。ORF2主要編碼Cap蛋白，Cap蛋白分子量大小約27. 8 ku，由233個～234個氨基酸構(gòu)成，該蛋白是PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，完整的病毒顆粒由Cap蛋白包裹病毒基因組而形成，以及該蛋白與豬圓環(huán)病毒2型的感染與免疫有著密切關(guān)系[15]。因此，Cap蛋白常常作為研發(fā)PCV2疫苗和PCV2檢測方法的目的蛋白[16-18]。本研究主要以PCV2的ORF2基因為參考序列，以PCV2毒株(CAU0673)的DNA為模板，設(shè)計了編碼Cap蛋白的表達引物，誘導表達該氨基酸片段，并對表達產(chǎn)物進行鑒定，探討該重組蛋白的反應原性，為后續(xù)的診斷方法或試劑盒開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 pET30a(+)載體，Novagen公司產(chǎn)品；即用型透析袋，Spectrum公司產(chǎn)品；Ni-NTA樹脂，Qiagen公司產(chǎn)品；PCV2毒株(CAU0673)，中國獸藥監(jiān)察所保存；PCV2陽性血清、NA-PRRSV陽性血清，VMRD公司產(chǎn)品；PPV1陽性血清，豬細小病毒滅活疫苗(WH-1株，購于中牧實業(yè)股份有限公司)制備的高免陽性血清；NA-PRRSV-N重組蛋白、PPV1-VP2重組蛋白，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室抗體工程課題組實驗室制備；Trans109感受態(tài)和BL21(DE3)感受態(tài)，抗體工程課題組實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL 2 000、蛋白分子質(zhì)量標準、BamH Ⅰ、XhoⅠ限制性酶，TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒，AxyPrep公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗豬IgG，Sigma公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母提取物， Oxoid(英國)公司產(chǎn)品；卡那霉素，Hyclone公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的PCV2的ORF2基因為參考序列(登錄號：DQ235696)，設(shè)計Cap蛋白編碼區(qū)的表達特異性引物，在上游引物加上BamH I限制性酶切位點，在下游引物加上XhoI限制性酶切位點。上游引物P1：5′-CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3′；下游引物P2：5′-CCGCTCGAGTCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3′，引物由Invitrogen(上海)公司合成。

1.2.2 病毒DNA提取與PCR擴增 按照TaKaRa公司 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒的操作說明提取PCV2毒株(CAU0673)DNA，以抽提的DNA為模板，采用50 μL反應體系，即Ex-Taq酶25 μL，上、下游引物各1 μL，模板 2.5 μL，補水至50 μL。反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，樣品置-20 ℃保存。

1.2.3 pET30a-PCV2-ORF2重組載體的構(gòu)建與鑒定 利用BamH I和XhoI分別對pET30a(+)載體和DNA凝膠回收產(chǎn)物進行酶切反應，反應體系為：PCR膠回收產(chǎn)物或pET30a(+)載體20 μL，10×K buffer 3 μL，BamH I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O 3 μL，總體積為30 μL。輕微振蕩混勻，瞬時離心，先放入30 ℃水浴3 h，再37 ℃水浴3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶16 ℃連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于Trans109大腸埃希菌感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素抗性的LA平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落過夜培養(yǎng)，離心收菌，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行BamH I、XhoI酶切鑒定，將構(gòu)建成功的pET30a-PCV2-ORF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，并按上述相同方法培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒分別進行PCR鑒定和BamH I、XhoI酶切鑒定，反應產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時將陽性重組質(zhì)粒送往GENEWIZ(金唯智)公司進行測序。

1.2.4 重組蛋白表達及SDS-PAGE電泳鑒定 分別設(shè)置終濃度為0.5、1、2 mmol/L的IPTG，誘導溫度為25、30、37 ℃，誘導時間為6、12、24 h，優(yōu)化誘導表達條件；將篩選出的陽性重組質(zhì)粒的表達菌(即大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài))于37 ℃振蕩培養(yǎng)約3 h，至OD nm 600值為0.6～1.0時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG于37 ℃誘導6 h，12 000 r/min離心收菌，ddH2O懸浮洗滌，對菌體進行SDS-PAGE電泳分析，觀察重組蛋白表達情況，再對重組菌體懸浮液進行超聲破碎，離心收集上清裂解液和沉淀，分別進行SDS-PAGE電泳分析，分析重組蛋白的存在方式。

1.2.5 重組蛋白Ni-NTA樹脂純化及復性 按照QIAGEN公司的Ni-NTA樹脂使用說明書對以包涵體形式表達的重組蛋白分別用包涵體洗滌緩沖液(pH8.0)、2 mol/L尿素洗滌2次～3次，離心棄上清液保留沉淀，再用buffer B(pH8.0)溶解包涵體沉淀，離心棄沉淀保留上清液。將樣品與Ni- NTA樹脂室溫結(jié)合40 min，上柱，然后分別用buffer C(pH6.3)、buffer D(pH5.9)、buffer E(pH4.5)洗滌柱子，并分別收集對應積份，對每個積份進行SDS-PAGE分析，確定目的蛋白存在于何種積份，并測定含有目的蛋白條帶積份的OD 280 nm值。再將純化后的蛋白液依次放于8、4、2、1 mol/L尿素、PBS液中進行透析復性，每種透析液透析時間為6 h，最后對復性蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組蛋白的Western blot分析 純化的復性重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加PCV2陽性血清(1∶100稀釋)于室溫搖床孵育1 h，PBST緩沖液洗滌PVDF膜3遍，再加HRP標記的豬二抗(1∶5 000稀釋)于室溫搖床孵育1 h，PBST緩沖液洗PVDF膜3遍，HRP-DAB底物顯色試劑避光顯色10 min，暗室中曝光，同時設(shè)pET30a空載體誘導表達菌作為陰性對照；采用上述相同的方法將復性PCV2-Cap重組蛋白與復性NA-PRRSV-N重組蛋白，復性PCV2-Cap重組蛋白與復性PPV1-VP2重組蛋白分別轉(zhuǎn)印至2張PVDF膜，脫脂奶粉封閉，分別加豬繁殖與呼吸綜合征病毒(NA-PRRSV)陽性血清(1∶100稀釋)、豬細小病毒1型(PPV1)陽性血清(1∶100稀釋)作為一抗，再加HRP標記的兔抗豬二抗(1∶5 000稀釋)，顯色曝光。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

以PCV2毒株(CAU0673)DNA為模板，P1、P2為引物，擴增獲得1條約702 bp的目的片段，而陰性對照組無目的片段(圖1)，與預期結(jié)果相符合。

M.DNA 標準DL 2 000;1.PCV2-ORF2的PCR擴增產(chǎn)物；2.陰性對照

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-PCV2-ORF2經(jīng)PCR鑒定，獲得702 bp的部分ORF2基因目的片段，而陰性對照無目的條帶(圖2)；重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I、XhoI酶切鑒定，獲得702 bp的ORF2基因片段和5 422 bp的pET30a(+)載體片段(圖3)。

M.DNA 標準DL 2 000;1、2重組質(zhì)粒pET30a-PCV2-ORF2(BL21)PCR產(chǎn)物； 3、4.重組質(zhì)粒pET30a-ORF2(Trans109)PCR產(chǎn)物；5.陰性對照

M.DNA 標準DL 2 000;1.pET30a-PCV2-ORF2重組質(zhì)粒；2～4. pET30a-PCV2-ORF2用BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物

2.3 重組蛋白表達、Ni-NTA樹脂純化及復性結(jié)果

大腸埃希菌BL21(DE3)表達菌在IPTG終濃度為1 mmol/L、誘導溫度37 ℃、誘導時間6 h的條件下，進行誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)表達產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為34 ku，與理論值相一致，同時發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式存在(圖4)，Ni-NTA樹脂純化的目的蛋白主要集中于E2～E7積份，其中在E2-E5階段出現(xiàn)較集中的洗脫峰(圖5和圖6)。

2.4 重組蛋白的Western blot分析結(jié)果

PCV2-Cap重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用PCV2陽性血清檢測重組蛋白的反應原性。結(jié)果表明，在34 ku處出現(xiàn)特異性的顯色條帶，而pET30a空載體處無特異性條帶(圖7)。因此，PCV2-ORF2重組蛋白與PCV2陽性血清發(fā)生特異性反應，具有良好的反應原性。同時，復性后的純化重組蛋白不與PPV1、NA-PRRSV陽性血清發(fā)生交叉反應，這表明該重組蛋白具有很好的特異性(圖7)。

3 討論

豬圓環(huán)病毒2型作為嚴重影響國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一，豬感染該病毒后，其免疫機能及生產(chǎn)機能降低，常常發(fā)生壞死性淋巴結(jié)炎、繁殖障礙、呼吸道綜合征和壞死性肺炎、豬皮炎腎病綜合征、增生性腸炎、滲出性表皮炎等多系統(tǒng)疾病[19]。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.pET30a空載體；2.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導前菌體；3.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導超聲破碎后沉淀；4.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導后菌體；5.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導、超聲破碎后上清液；6.純化后復性PCV2-Cap蛋白

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.E1液；2.E2液；3.E3液；4.E4液；5.E5液；6.E6液；7.E7液；8.E8液；9.E9液

圖6 各積分的蛋白濃度

由于透明帶作用的消失，病毒感染胚胎后，導致胚胎或胎兒死亡[20]。由ORF2編碼的Cap蛋白作為病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，常用于PCV2疫苗和診斷方法的研究。徐文娟等[21]采用細菌展示技術(shù)(APEx) 系統(tǒng)的篩選位于PCV2b-Cap蛋白上的抗原表位，為該蛋白的深入研究奠定了基礎(chǔ)。張璐等[22]對非核定位信號區(qū)的Cap蛋白進行了誘導表達純化，并制備單克隆抗體，分析了該區(qū)域的抗原表位，為PCV2在胚胎孵育過程中，血清學診斷和抗原檢測奠定了基礎(chǔ)。目前，有學者采用桿狀病毒系統(tǒng)、枯草芽胞桿菌等對Cap蛋白進行表達研究[23-24]。大腸埃希菌表達載體作為非常成熟的表達載體，其擁有生長速度快、便于培養(yǎng)等特點，并且其中的pET30a載體可用于目的基因的大量誘導表達[25]。

1，2，6，8.PCV2-Cap重組蛋白；3，4，7.pET30a空載體；5.NA-PRRSV重組N蛋白； 9.PPV1-VP2重組蛋白

本試驗通過擴增PCV2-ORF2基因(長度為702 bp)，構(gòu)建pET30a-PCV2-ORF2重組表達載體，BamH I、XhoI酶切鑒定呈陽性。重組大腸埃希菌表達系統(tǒng)在IPTG的誘導下，誘導表達出大小約為34 ku的重組Cap蛋白，研究發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。通過Ni-NTA樹脂對包涵體蛋白進行純化，得到較高純度的目的重組蛋白，并對純化后蛋白進行復性處理；研究發(fā)現(xiàn)，復性后的重組蛋白純度高于復性前，由于蛋白復性是一個非常復雜的過程，這可能是重組蛋白在恢復高級結(jié)構(gòu)的過程中，在蛋白疏水鍵的形成以及透析膜的濾過等作用下，對重組蛋白完成了一定程度的純化作用[26]。重組Cap蛋白與PCV2陽性血清進行Western blot反應呈陽性，表明該重組蛋白具有很好的反應原性，與NA-PRRSV、PPV1陽性血清Western blot反應呈陰性，表明不與NA-PRRSV、PPV1陽性血清發(fā)生交叉反應。因此，該重組Cap蛋白可被用于豬圓環(huán)病毒2型的診斷方法或試劑盒的后續(xù)研究，為豬圓環(huán)病毒2型的防控和診斷奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression of ORF2 Gene Fragment of Porcine Circovirus Type 2 and the Reactinogenicity Analysis of the Expressed Protein

OU Yun-wen1,2,MA Xiao-yuan2,WANG Jun2,DING Yao-zhong2,ZHANG Yong-guang2,ZHANG Jie2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China;2StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu,730046,China)

This experiment was aimed to study the antigenicity of Cap protein of porcine circovirus type 2(PCV2).The gene was amplified from the DNA of PCV2-CAU0673 strain by PCR,whose product was approximately 702 bp.The product was cloned into pET30a(+)vector,PCR,digestion and sequencing were used to identify positive plasmid.The positive recombined plasmid was expressed byE.coliBL21 (DE3) and was induced by IPTG.The recombinant protein was purified by Ni-NTA and refolding.The results of SDS-PAGE showed that the recombined protein was successfully expressed inE.coliBL21 (DE3) with a relative molecular weight of 34 ku.The results of Western blot showed that this recombined protein was specifically reacted with PCV2 positive serum;no cross reacted with NA-PRRSV and PPV1 positive serum.The recombinant vector pET30a-PCV2-ORF2 was successfully constructed,and the recombined Cap protein with excellent reactinogenicity was successfully expressed inE.coliwhich laid a foundation for the diagnosis of PCV2.

Porcine circovirus type 2；ORF2 gene；prokaryotic expression；reactinogenicity

2016-07-28

國家國際合作項目 (2012DFG31890)；國家自然科學基金項目(31072143) 作者簡介：歐云文(1990-)，男，重慶人，碩士，主要從事人獸共患病及公共衛(wèi)生學研究。

S852.659.2

A

1007-5038(2017)04-0001-06

*通訊作者