張德靜+牛小彩

摘 要 目的：建立復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷含量的測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法、C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、流速1.2 ml/min，柱溫25 ℃，波長(zhǎng)280 nm測(cè)定，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（27∶73）。結(jié)果：在不同中藥制劑中，黃芩苷峰形良好，方法專屬性強(qiáng)。在濃度為16～320 μg/ml范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 3）；在50%、100%、150%的濃度下，二制劑中黃芩苷的回收率分別為99%及97%，RSD分別為1.7%和1.6%。此外，黃芩苷在8 h內(nèi)含量變化的RSD分別為0.3%和0.2%，穩(wěn)定性良好。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷的含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 復(fù)方地黃合劑 復(fù)方逍遙合劑 黃芩苷 HPLC

中圖分類號(hào)：R927.2； R286 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）05-0066-05

Determination of baicalin content in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutions

ZHANG Dejing*， NIU Xiaocai

（Department of R&D， Shanghai Meiyou Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201423， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of baicalin content in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutions. Methods： The established HPLC method was carried out on a C18 column at detection wavelength of 280 nm with a mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （27 ： 73）. Results： The peak shape of baicalin in different preparations of traditional Chinese medicine and the specificity of the method were good. The standard curve of baicalin showed a good linear relationship over the range of 16- 320 μg/ml （r=0.999 3）. The average recoveries were 99% with RSD 1.7% for compound Dihuang oral solution and 97% with RSD 1.6% for compound Xiaoyao oral solution under the concentrations of 50%， 100%， 150% of original ones. Besides， the RSD of baicalin content change was 0.3% and 0.2% in 8 hours of storage， indicating its good stability. Conclusion： This method is convenient and accurate with high sensitivity and good reproducibility， can be used to determine the content of baicalin in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutions.

KEY WORDS compound Dihuang oral solution； compound Xiaoyao oral solution； baicalin； HPLC

黃芩苷（baicalin）是從黃芩根中提取分離出來(lái)的一種黃酮類化合物，具有顯著的生物活性，具有降壓、鎮(zhèn)靜、保肝、利膽、抗菌、消炎、抗腫瘤等作用和生理功效[1-2]，在臨床醫(yī)學(xué)已占有重要地位。各種藥物制劑，如雙黃連口服溶液、柴黃口服溶液、芩?；殿w粒、復(fù)方地黃合劑、復(fù)方逍遙合劑等，均含有黃芩苷，且黃芩苷含量作為藥品質(zhì)量控制的關(guān)鍵項(xiàng)目。因此，黃芩苷含量的測(cè)定方法至關(guān)重要。

根據(jù)文獻(xiàn)查閱，黃芩苷含量測(cè)定方法較多，如薄層掃描法[3]、薄層-紫外法[4]、紫外分光光度計(jì)法[5]、HPLC法[6]、高效毛細(xì)管電泳法等[7]，各種方法均存在一定的優(yōu)劣性[8-9]，如耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜等。本研究建立了新的黃芩苷含量的測(cè)定方法，有利于復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑的質(zhì)量控制。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相儀（美國(guó)安捷倫公司）；Thermo U3000型高效液相儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Waters 2695型高效液相儀（沃特世科技有限公司）；電子天平（型號(hào)BS124S，賽多利斯）。

1.2 樣品與試劑

復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑（上海美優(yōu)制藥有限公司，批號(hào)150102、150102）；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)1107515-201318）。

乙腈及甲醇（色譜純，默克公司）；磷酸和乙醇（分析純，永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司）；蒸餾水（自制）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

精密量取樣品2 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇約30 ml，超聲處理10 min，放冷后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋成濃度為60 μg/ml的對(duì)照品溶液。

按照復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑的配方，剔除中藥飲片黃芩，模擬生產(chǎn)工藝分別制備復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑的空白樣品；依次精密移取空白樣品2 ml，分別置50 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑的空白對(duì)照溶液。各取9份空白溶液2 ml，均置于50 ml容量瓶中，將濃度為2 mg/ml對(duì)照品溶液1、2和3 ml分別加入各三份空白溶液中，加入甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為準(zhǔn)確度測(cè)試加樣供試品溶液。

1.3.2 色譜條件

采用高效液相色譜法，C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），波長(zhǎng)280 nm，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（27∶73），流速1.2 ml/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μl。

1.3.3 線性和范圍

精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為320 μg/ml對(duì)照品貯備液，依次稀釋制備成濃度梯度為240、160、80和16 μg/ml的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別注入液相色譜儀（Agilent 1200）測(cè)定并記錄色譜圖。

1.3.4 方法驗(yàn)證

1）專屬性 取空白對(duì)照溶液、供試品溶液以及對(duì)照品溶液各20 μl，分別注入高效液相色譜儀（Agilent 1200）測(cè)定并記錄色譜圖。另取復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑的供試品溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀（Waters 2695），采用PDA檢測(cè)器，測(cè)定并記錄色譜圖。

2）準(zhǔn)確度 取準(zhǔn)確度測(cè)試加樣供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。

3） 重復(fù)性 取兩種制劑的供試品溶液各6份進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖（Agilent 1200）。

4）中間精密度 由不同試驗(yàn)人員將供試品溶液注入不同液相色譜儀（Agilent 1200、Thermo U3000）測(cè)定并記錄色譜圖，觀察黃芩苷含量的變化。

5）溶液穩(wěn)定性 分別在0、1、2、4、6和8 h進(jìn)樣（Agilent 1200）測(cè)定，以0 h峰面積為準(zhǔn)，計(jì)算復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑的供試品溶液在8 h內(nèi)峰面積的變化。

6）耐用性 取供試品溶液20 μl進(jìn)樣（Agilent 1200），通過(guò)改變柱溫、流速及流動(dòng)相比例，考察其對(duì)含量測(cè)定的影響。條件如下：①乙腈-0.2%磷酸溶液=27∶73、流速1.2 ml/min，柱溫分別為20、25和30 ℃；②乙腈-0.2%磷酸溶液比例分別為25∶75、27∶73及21∶79，柱溫25 ℃、流速1.2 ml/min；③乙腈-0.2%磷酸溶液=27∶73、柱溫25 ℃，流速分別為1.0、1.2和1.4 ml/min。

2 結(jié)果

2.1 線性和范圍

在16～320 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得線性方程為y=0.926 5x -3.144 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3，表明在該濃度范圍內(nèi)，線性符合規(guī)定。

2.2 專屬性

在1.3.2的色譜條件下，黃芩苷主峰保留時(shí)間為7.82 min，空白對(duì)照溶液在黃芩苷主峰的相應(yīng)位置無(wú)干擾峰出現(xiàn)，供試品溶液與對(duì)照品溶液黃芩苷主峰的保留時(shí)間一致（圖1）。PDA檢測(cè)結(jié)果角度值均小于閾值，表明黃芩苷色譜峰僅為單一成分在280 nm波長(zhǎng)下的響應(yīng)值，含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)。

2.3 準(zhǔn)確度

在相對(duì)于樣品50%、100%、150%不同濃度下，復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷的平均回收率分別為99%和97%（表1），RSD分別為1.7%和1.6%，回收率良好。

2.4 重復(fù)性

復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑供試品溶液各6份含量測(cè)定的RSD分別為1.6%和0.4%（表2），RSD小于2%，表明具有較好的重復(fù)性。

2.5 中間精密度

由不同操作人員、采用不同色譜系統(tǒng)測(cè)定，復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果RSD小于2.0%，黃芩苷中間精密度良好（表3）。

2.6 溶液穩(wěn)定性

在0～8 h內(nèi)，黃芩苷峰面積相對(duì)穩(wěn)定，復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷峰面積變化的RSD分別為0.3%和0.2%（表4），均小于2%，說(shuō)明穩(wěn)定性良好。

2.7 耐用性

對(duì)于流動(dòng)相比例、柱溫和流速的考察表明，改變色譜條件時(shí)，黃芩苷色譜峰的理論板數(shù)均大于2 000，黃芩苷主峰與相鄰峰分離度均大于1.5，發(fā)現(xiàn)最佳色譜條件為：流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（27∶73），流速1.2 ml/min，柱溫25 ℃。

3 討論

在流動(dòng)相選擇方面，乙腈具有溶劑強(qiáng)度較高，黏度較小，其截止波長(zhǎng)190 nm 比甲醇205 nm更短，更適合末端吸收進(jìn)行黃芩苷含量的檢測(cè)。本研究中色譜檢測(cè)流動(dòng)相有機(jī)溶劑為乙腈，結(jié)果表明在該流動(dòng)相下，黃芩苷主峰與鄰近峰分離度良好，峰形理想。在黃芩苷萃取及樣品制備方面，常采用溶劑為乙醇及甲醇，經(jīng)超聲及加熱回流可高效完成有效成分的萃取。經(jīng)過(guò)PDA檢測(cè)，黃芩苷在280 nm波長(zhǎng)下僅為單一色譜峰，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法具有簡(jiǎn)單、快捷、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、耐用性好的特點(diǎn)，適用于含黃芩苷的中藥以及制劑的含量測(cè)定。

與其它研究[6]相比，本研究明顯縮短了黃芩苷的測(cè)定時(shí)間，提高了工作效率，擴(kuò)大了該方法的應(yīng)用范圍。本研究與2015版中國(guó)藥典[10]關(guān)于藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析驗(yàn)證指導(dǎo)原則相一致。然而，鑒于中藥制劑成分的復(fù)雜性，本方法僅為黃芩苷含量的測(cè)定提供參考。

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