譚彬+郭水歡+韓亞萍+鄭先波++葉霞?├羆潭?+馮建燦

摘要：分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合對(duì)毛桃葉片愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量的影響，并對(duì)不同處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明適合毛桃組培苗葉片愈傷組織再生的最適培養(yǎng)基為MS+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量分別為88.09%和3；適合毛桃胚培苗葉片愈傷組織再生的最適培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量分別為69.77%和4。2種來(lái)源葉片外植體最適培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織其愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量雖有差異，但所產(chǎn)生的愈傷組織均為黃綠色，緊實(shí)有突起，具備良好的再生能力。

關(guān)鍵詞：毛桃（Prunus persica）；葉片；愈傷組織；誘導(dǎo)；再生

中圖分類號(hào)： S662.104+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0037-03

我國(guó)是世界第一產(chǎn)桃大國(guó)，但桃砧木的利用還處在比較原始的狀態(tài)，生產(chǎn)上一般都是直接采用野生桃種子（如毛桃、山桃、甘肅桃等）或生產(chǎn)品種（如青州蜜桃）的種子做砧木[1]。其中野生毛桃（Prunus persica）是我國(guó)應(yīng)用最為廣泛的桃樹(shù)砧木，其根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)健壯，與栽培品種嫁接親和性好[2]，抗根結(jié)線蟲(chóng)能力較強(qiáng)，而抗真菌、耐旱性一般[3-4]。與常規(guī)桃育種相比，砧木育種周期更長(zhǎng)，更加費(fèi)時(shí)費(fèi)力[1]?，F(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，為通過(guò)基因工程方法提高毛桃抗性、提高育種效率提供了可能。

高效穩(wěn)定再生體系是開(kāi)展桃遺傳轉(zhuǎn)化工作的基礎(chǔ)，由于缺乏穩(wěn)定、高效的再生體系，桃基因工程、功能基因鑒定等方面研究與應(yīng)用受到嚴(yán)重制約?；蛐汀⑼庵搀w類型和狀態(tài)、基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、培養(yǎng)條件等均對(duì)桃離體再生有影響。劉航空等以早熟油桃華光和曙光為試材，對(duì)影響早熟油桃葉片產(chǎn)生胚性愈傷的多個(gè)因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明外源激素對(duì)誘導(dǎo)桃葉片產(chǎn)生胚性愈傷組織影響顯著[5]。齊賢等以黃水蜜桃為對(duì)象，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)其胚培苗莖段愈傷組織形成率的影響，結(jié)果表明添加2.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基，其愈傷組織形成率為85%[6]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于桃砧木組織培養(yǎng)方面的研究較少，研究對(duì)象多為GF677和 Nemaguard[7-8]；所用外植體主要為莖尖、子葉[9-11]等，而葉片[8，12]報(bào)道較少?；诖耍狙芯糠謩e以桃砧木類型毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，為高效穩(wěn)定再生體系建立和遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料毛桃幼嫩枝條和自交果實(shí)分別于2015年4月和8月采自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)三區(qū)桃資源圃。

1.2方法

1.2.1無(wú)菌組培苗的獲得

毛桃幼嫩枝條在晴天10：00左右，取田間新梢裝入潔凈塑料袋帶回室內(nèi)，去掉葉片并保留部分葉柄；用洗衣粉漂洗20 min，經(jīng)流水沖洗2 h。然后在無(wú)菌條件下，剪取帶有腋芽的莖段（1.5～2.0 cm），用70%乙醇浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗2～3遍，再用0.1%的HgCl2處理 6 min，再用無(wú)菌水沖洗2～3遍，接種于初代培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)萌芽率；培養(yǎng)4周后將萌發(fā)的芽切下后繼代培養(yǎng)，以獲得的無(wú)菌組培苗葉片為外植體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。初代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+GA3 0.5 mg/L+AgNO3 0.5 mg/L培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)是在原培養(yǎng)基中再添加200 mg/L頭孢霉素、蔗糖30 g/L、瓊脂6.8 g/L，PH值5.7，培養(yǎng)條件為溫度（26±2） ℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照度為1 500～2 000 lx，每日光照14 h（下同）。

1.2.2胚培苗的獲得

毛桃胚培苗的獲得參照齊賢等的方法[6]略作修改。具體操作步驟如下：將采摘的毛桃果實(shí)去除果肉，沖洗干凈后將桃核用5%（體積分?jǐn)?shù)）的次氯酸鈉消毒20 min，用錘子砸開(kāi)桃核取出核仁，在超凈工作臺(tái)上用70%酒精浸泡核仁30 s，用無(wú)菌水沖洗2～3遍，然后用0.1%（質(zhì)量濃度）的HgCl2消毒5 min，用無(wú)菌水沖洗5次，將滅菌的核仁接種在WPM培養(yǎng)基上，放進(jìn)4 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)45 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。光照培養(yǎng)14 d和28 d后分別調(diào)查萌芽率和成苗率，并以獲得的胚培苗葉片為外植體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3毛桃愈傷組織的誘導(dǎo)

葉片外植體分別取自組培苗和胚培苗，選取生長(zhǎng)良好、完全展開(kāi)的幼嫩葉片，垂直主脈橫切2～3刀，不傷及葉緣，將近軸面向上平鋪于培養(yǎng)基上。不同處理所用基本培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L AgNO3，不同處理培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度如表1所示。每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。接種后進(jìn)行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，光培養(yǎng)1周后分別調(diào)查不同處理愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量，并記錄愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)。暗培養(yǎng)溫度為（26±2） ℃，相對(duì)濕度 60%～70%。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響[HT]

將帶有腋芽的毛桃莖段經(jīng)消毒處理后接種至培養(yǎng)基（圖1-A），培養(yǎng)1周后腋芽開(kāi)始萌發(fā)（圖1-B），培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)萌芽率為69.02%，繼續(xù)培養(yǎng)2周后將萌發(fā)的腋芽切下轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)4周后獲得生長(zhǎng)旺盛的無(wú)菌組培苗（圖1-C）。將獲得的無(wú)菌組培苗葉片分別接種至添加不同種類和濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1周后，部分葉片葉柄處和切口開(kāi)始產(chǎn)生愈傷組織，隨著暗培養(yǎng)的時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)明顯增多，暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)1周，5個(gè)處理大部分葉片切口處均產(chǎn)生愈傷組織（圖1-D至圖1-H）。此時(shí)觀察不同處理愈傷組織顏色和生長(zhǎng)狀態(tài)（圖1-D至圖1-H，表2），其中處理1誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為淺綠色，松散，輕微褐化，有光澤（圖1-D）；處理2誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為白色，較松散，成海綿狀（圖1-E）；處理3誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，緊實(shí)有突起，表面光滑（圖1-F）；處理4誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織黃綠色，且有白色，松散，成海綿狀，褐化（圖1-G）；處理5誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為綠色，有突起，輕微褐化

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度對(duì)毛桃組培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量的影響如表2所示。MS培養(yǎng)基中添加1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率最高，為88.09%；當(dāng)2，4-D濃度一定時(shí)，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率明顯高于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2），而愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量則相反；當(dāng)TDZ濃度一定時(shí)，TDZ與2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量高于TDZ與NAA組合（處理4）；培養(yǎng)基中沒(méi)有添加TDZ和2，4-D時(shí)，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量最低，分別為6714%和1。綜合分析可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA（處理3）。

[HTK]2.2不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)毛桃胚培苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響[HT]

將滅菌的毛桃核仁接種在WPM培養(yǎng)基上（圖2-A），4 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)45 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d和28 d后分別調(diào)查萌芽率和成苗率，均為95%。從生長(zhǎng)健壯的胚培苗（圖2-B）上取葉片接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)1周后，部分葉片葉柄處和切口開(kāi)始產(chǎn)生愈傷組織，隨著暗培養(yǎng)的進(jìn)行產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)明顯增多，暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)1周，發(fā)現(xiàn)5個(gè)處理大部分葉片切口處均產(chǎn)生愈傷組織（圖2-C至圖2-G），但不同處理產(chǎn)生的愈傷組織顏色和狀態(tài)存在一定差異（圖2 C-G，表3）。其中處理1誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，略帶白色，松散（圖2-C）；處理2誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為黃色，松散，成海綿狀（圖2-D）；處理3誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為黃白色，松散，輕微褐化（圖2-E）；處理4誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織黃綠色，緊實(shí)有突起（圖2-F）；處理5誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為黃白色，有突起（圖2-G）。此外，不同處理中愈傷組織主要產(chǎn)生的部位也有差異（圖2-C至圖2-G）， 除處理5誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織主要

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度對(duì)毛桃胚培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量的影響如表3所示。當(dāng) 1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L KT（處理2）共同使用時(shí)，愈傷組織形成率最高，為80.68%，但此處理產(chǎn)生的愈傷組織松散、成海綿狀，此種狀態(tài)愈傷組織不具備再生能力；而當(dāng)培養(yǎng)基中沒(méi)有添加TDZ和2，4-D時(shí)，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率最低（66.02%），這一結(jié)果與毛桃組培苗葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織結(jié)果一致（67.14%，最低），但該處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織沒(méi)有發(fā)生褐化；當(dāng)2，4-D濃度一定時(shí)，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率低于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2）；當(dāng)TDZ濃度一定時(shí)，TDZ和2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率與TDZ和NAA組合差異不顯著（處理4），此結(jié)果與毛桃組培苗葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織結(jié)果相反，但處理4的愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量高于處理3，且處理4產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，緊實(shí)有突起，此種狀態(tài)的愈傷組織具備良好的再生能力。綜合愈傷組織顏色和狀態(tài)、愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA（處理4）。

3結(jié)論與討論

外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桃葉片的愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著，其中TDZ和BA被認(rèn)為是誘導(dǎo)效果比較好的細(xì)胞分裂素，而生長(zhǎng)素常用的有2，4-D和NAA。叢芳等以桃栽培品種曙光、金童5號(hào)和甜桃王試管苗[JP2]葉片為外植體，研究了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)葉片再生的影響，結(jié)果表明3種基因型試管苗葉片在LP+0.4 mg/L

TDZ培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，且愈傷組織形成率均最高，分別達(dá)到72.2%、78.8%和71.3%[13]；張永慶等以奉化玉露桃不同外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)，其中以幼葉為外植體得到的愈傷組織誘導(dǎo)率為70%，且得到的愈傷組織為深綠色，硬實(shí)，粉狀，多次繼代培養(yǎng)后發(fā)褐衰老[14]；而本研究中以毛桃組培苗葉片為外植體研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為 MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，愈傷組織形成率為88.09%，明顯高于叢芳等的研究結(jié)果[11-12]，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，緊實(shí)有突起，表面光滑。

此外，同一基因型相同外植體因其來(lái)源不同其愈傷組織形成率、愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量及愈傷組織狀態(tài)均有差異?，F(xiàn)有關(guān)于桃葉片離體培養(yǎng)的報(bào)道中所用葉片主要取自田間枝條消毒處理后培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗[8，12，15]，而用胚培苗葉片的尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，2種來(lái)源葉片在不同培養(yǎng)基中均成功誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，不同處理中愈傷組織形成率最高分別可達(dá)88.09%和88.68%；但結(jié)合愈傷組織形成率、愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量及愈傷組織狀態(tài)綜合分析發(fā)現(xiàn)，2種來(lái)源的葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基卻不相同，其中組培苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基中添加的是2，4-D和 6-BA，而胚培苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基中添加的是TDZ和NAA，這種差異的產(chǎn)生可能與2種來(lái)源葉片本身的生理狀態(tài)有關(guān)。

桃樹(shù)通過(guò)愈傷組織和體細(xì)胞再生系統(tǒng)途徑再生的研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢，而植物遺傳轉(zhuǎn)化的眾多研究已經(jīng)證明通過(guò)愈傷組織再生系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率較高，因此，建立一個(gè)高效且適宜于桃遺傳轉(zhuǎn)化的通過(guò)愈傷組織或胚狀體再生途徑的再生系統(tǒng)已成為開(kāi)展轉(zhuǎn)基因工作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。本研究初步獲得了大量生長(zhǎng)狀態(tài)良好、穩(wěn)定一致的毛桃愈傷組織，為后續(xù)通過(guò)愈傷組織途徑建立再生體系和通過(guò)基因工程方法進(jìn)行毛桃種質(zhì)的改良奠定基礎(chǔ)。

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