周軍+朱暖飛+邵啟運+黃夢璐+張禎+吳向陽

摘要：采用制備的鄰苯二甲酸二丁酯多克隆抗體建立可檢測環(huán)境水體中痕量鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的間接競爭酶聯(lián)免疫（ELISA）分析方法，對各種參數(shù)進行優(yōu)化后，在最優(yōu)條件下本方法具有較高的靈敏度（檢測限為 66.6 ng/mL）、較寬的檢測范圍（70～1 600 ng/mL）、較好的準確度（回收率82.8%～104.0%）。利用此高通量分析方法對鎮(zhèn)江部分河流中水樣、底泥進行分析，結果發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)江市區(qū)幾處河流，DBP普遍檢出，水樣中DBP濃度為76.5～140.4 ng/mL，底泥中DBP濃度可達114.6～248.7 ng/g。

關鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯；酶聯(lián)免疫；抗體；水體；鎮(zhèn)江

中圖分類號：X824文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0289-03

鄰苯二甲酸酯類物質（phthalateesters，PAEs）是一類大量應用于塑料及一次性塑料消費品（食品包裝材料、容器、醫(yī)療用品）的增塑劑，還可以作為原料用于香味劑、化妝品和冷凝劑，這類化合物的使用，造成了全球性的污染[1]。其中，鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在被檢出的PAEs樣品中分布最為廣泛[2]，F(xiàn)atoki等對南非East London港中DBP濃度進行了分析，其含量可達2.8～121.9 ng/mL[3]；Adeniyi等報道稱尼日利亞的河水中DBP的含量為202.5～270.5 ng/mL[4]；陸繼龍等對第二松花江中下游中DBP濃度進行了測定，其平均濃度高達717.24 ng/mL[5]。同時，研究表明，DBP具有明顯的生殖毒性：可以引起染色體丟失或斷裂等畸變，阻礙正常精子的生成[6]；可導致雄性兔與大鼠生殖道畸形，睪丸萎縮，從而造成其生殖系統(tǒng)損傷[7]。因此，建立簡單、快速高通量的分析方法，對水體中此類污染物進行分析極其必要。DBP分子的化學結構如圖1所示。

目前報道的有關分析DBP的方法主要有氣相色譜-質譜法[8]、液相色譜法[9]、LC-MS/MS[10-11]等儀器方法，然而，由于這類方法存在測試成本高、分析時間長、檢測所需樣品量大（通常大于500 mL）及前處理步驟繁瑣等不足，無法在較大范圍內(nèi)系統(tǒng)、全面、快速分析環(huán)境水體中DBP的含量。與此相比，酶聯(lián)免疫法（ELISA）具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測成本低、適合高通量分析的優(yōu)勢。因此，本研究利用自主制備的DBP多克隆抗體，建立了高靈敏的ELISA方法，優(yōu)化了影響方法靈敏度與準確度的各種因素，并以此方法對鎮(zhèn)江地區(qū)部分小型淺水河流中DBP的污染狀況進行了調查。

1材料和方法

1.1材料和試劑

DBP抗原抗體，由江蘇大學環(huán)境科學團隊制備；鄰苯二甲酸二丁酯標準品、乙酸乙酯、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、四甲基聯(lián)胺，均購自美國Sigma公司；Tween-20、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、碳酸鈉（Na2CO3）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、濃硫酸（H2SO4）等，均購自國藥集團化學試劑有限公司，且均為分析純；酶標板，購自丹麥NUNC公司。

碳酸鹽包被緩沖液CB：0.05 mol/L、pH值為9.6；封閉液：含1%明膠的CB液；洗滌液PBST：0.01 mol/L、pH值為7.4、含體積分數(shù)0.05% Tween-20的PBS液；抗體稀釋液：0.01 mol/L、pH值為7.4、0.01% Tween-20、0.1%明膠的PBS液；顯色液：10 mg鄰苯二胺、25 mL檸檬酸鈉緩沖液、5 μL 30%過氧化氫，用時混合；終止液：2 mol/L H2SO4。

1.2儀器設備

電子分析天平，購自重慶CoiC公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海精密科學儀器有限公司；酶標儀，購自美國Thermo公司。

1.3間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（ic-ELISA）的建立

采用方陣滴定法，確定抗原最佳包被濃度、抗體最佳包被濃度，為達到最佳檢測條件，對孵育條件、封閉時間、一抗競爭時間、二抗稀釋倍數(shù)、pH值、離子強度等影響因素進行優(yōu)化。

具體ic-ELISA操作步驟為：（1）包被：用包被液將稀釋的包被原加至酶標板，100 μL/孔，4 ℃過夜孵育；（2）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干；（3）封閉：加入150 μL/孔封閉液，37 ℃孵育1 h；（4）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用200 μL洗滌液洗1遍，在吸水紙上拍干；（5）加樣：每孔加入50 μL不同濃度的標準品和適當稀釋的待檢血清，37 ℃孵育30 min；（6）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用洗液洗3遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干；（7）加酶辣根過氧化物酶標記的二抗：加入 100 μL/孔 HRP-羊抗兔IgG，37 ℃孵育 30 min；（8）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用洗液洗5遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干；（9）顯色：加入新鮮配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光顯色10 min；（10）終止：加入終止液，50 μL/孔；（11）測定：用酶標儀讀取各孔D450 nm值。

1.4建立標準曲線及數(shù)據(jù)分析

根據(jù)以上優(yōu)化的結果，按照“1.3”節(jié)中的方法建立DBP的標準曲線。以零標準品D450 nm值為B0值，相應濃度標準品抑制時的D450 nm值為B值。以標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，以B/B0為縱坐標，繪制標準曲線。測定10份空白樣，取測定平均值減3倍標準偏差，標準曲線上其對應的濃度值即為檢測限（limit of detection，LOD）。

1.5交叉反應率的測定

選擇與鄰苯二甲酸二丁酯具有類似結構和類似功能的鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（benzyl butyl phthalate，BBP）、鄰苯二甲酸單乙酯（monoethyl phthalate，MEP）、鄰苯二甲酸單丁酯（monobutyl phthalate，MBP）、鄰苯二甲酸單乙基己基酯（monoethylhexyl phthalate，MEHP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DnOP）、鄰苯二甲酸二異辛酯[di（2-ethylhexyl）phthalate，DiOP]，測定得到各藥物的IC50值（抑制中點即抑制率為50%時對應的濃度），按公式（1）計算交叉反應率。

[JZ（]交叉反應率=DBP的 IC50值/相似結構物的IC50值×100%。

1.6樣品前處理及添加回收率的測定

各取2 mL（或2 mg泥土，自然陰干）的樣品，加入4 mL正己烷，振蕩搖勻后使用高速離心機6 000 r/min離心 10 min，取上清，并用氮吹儀吹干。最終樣品用2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）復溶。

取空白樣本，添加一定體積的DBP標準液，每個水平設3個平行。將混合物在漩渦混合器上渦動1 min，然后靜置 15 min。按建立的間接競爭ELISA方法測定，檢測時每份樣品做3個平行重復孔。將各樣品測得的D450 nm值代入標準曲線，計算出樣品中的藥物濃度，并根據(jù)公式（2）計算回收率。

[JZ（]回收率=實測值/添加值×100%。

2結果與分析

2.1間接競爭ELISA方法的建立與優(yōu)化

為達到最佳的檢測效果，本研究對影響方法的各種參數(shù)進行了優(yōu)化，包括抗原稀釋度、抗體稀釋度、孵育條件、封閉時間、一抗競爭時間、HRP稀釋度、pH值、離子強度。在最優(yōu)條件下（部分數(shù)據(jù)如表1所示），分別為：抗原稀釋度1 ∶[KG-*3]5 000、抗體稀釋度1 ∶[KG-*3]30 000、孵育條件4 ℃過夜、封閉時間1.5 h、一抗競爭時間30 min、HRP稀釋度1 ∶[KG-*3]2 000、pH值7.0、離子強度0.15 mol/L，以DBP濃度的LOG值為橫坐標，抑制百分比（B/B0）為縱坐標繪制標準曲線（圖2），其抑制程度與DBP的濃度具有明顯的線性關系（70～1 600 ng/mL），IC50值為421 ng/mL，檢測限可達66.6 ng/mL。

2.2交叉反應率測定

在最佳反應條件下，測定7種DBP的類似結構物，其中對BBP的交叉反應率為22.5%，對DEP的交叉反應率為 1.08%，其余5種均小于0.01%，從而可推斷該檢測體系所用的DBP抗體具有較強的特異性。根據(jù)免疫學的基本原理[12]：抗體傾向于識別距離偶聯(lián)段最遠的基團（主導的抗原決定簇）。對于所測定的7種PAEs，只有BBP在距離偶聯(lián)段最遠處，和DBP有相似的正丁基官能團，而其他PAEs均無。

2.3樣本添加回收試驗

[JP2]DBP在樣品中的添加回收率、變異系數(shù)如表2所示。結果表明，其添加回收率均值在82.8%～104.0%之間，變異系數(shù)均小于20%，顯示該方法的準確度和精確度均符合檢測要求。

2.4鎮(zhèn)江市內(nèi)小型淺水河流水體和底泥的檢測

表3為鎮(zhèn)江市部分小型淺水河流中DBP在水體、底泥中的含量。由表3可知，DBP作為一種常見增塑劑在環(huán)境水體中普遍存在。4條河流中，除玉帶河未檢測到（玉帶河離市區(qū)較遠，且河道定期清淤，故水質較好），其余3條河流水體中DBP的含量介于76.5～140.4 ng/mL之間，顯著高于臺灣河（1.0～13.5 ng/mL）[13]、意大利淡水（ND～0.028 ng/mL）[14]和加拿大False Creek港（9.32～63.9 ng/mL）[15]中DBP的含量，而且超過《地表水環(huán)境質量標準》（GB 3838—2002）中DBP的標準限值（3 ng/mL）[16]。顯然，DBP在3條市區(qū)河流中污染嚴重，這可能與河流周邊附近工業(yè)廢水的排放、固體廢棄物的堆放和雨水淋洗以及PVC塑料的緩慢釋放有關；另外下游的DBP含量明顯高于中游，可推斷出隨河流沿程增加，帶入水體中的污染物呈增加趨勢，導致DBP含量也隨之升高。

3結論

本研究建立了環(huán)境水體中DBP間接競爭ELISA分析方法。通過條件優(yōu)化，本方法的IC50值可達421 ng/mL，線性范圍為70～1 600 ng/mL，檢測限為66.6 ng/mL。同時，本方法具有較高的準確度與精確度（回收率為82.8%～104.0%，變異系數(shù)為3.25%～10.20%）。利用此方法對鎮(zhèn)江市部分小型淺水河流進行檢測分析，結果表明市區(qū)內(nèi)水體中DBP污染較為嚴重。本研究為DBP在鎮(zhèn)江區(qū)域的污染狀況調查、風險評估提供了一定的技術支持。

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