付岳 王瑞霞鄒迎曙李爾華高旭年王軍★

?述 評?

人巨細(xì)胞病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制與應(yīng)用

付岳1王瑞霞1鄒迎曙1李爾華2高旭年2王軍1★

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是威脅人類健康的最重要病原之一。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，HCMV核酸水平的檢測逐漸得到了廣泛的認(rèn)可，這也就需要研制HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來保證檢驗數(shù)據(jù)的真實可靠。本文簡要介紹了國內(nèi)外目前存在的HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制情況，并對這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在應(yīng)用中遇到的問題進(jìn)行了闡述，旨在為人巨細(xì)胞病毒核酸檢測診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化，以及為其質(zhì)量控制提供參考。

人巨細(xì)胞病毒；核酸；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）屬于β皰疹病毒亞科，病毒基因組大約235 kb。病毒感染具有嚴(yán)格的宿主特異性，例如人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）只能感染人［1］。HCMV感染在人群中很普遍但都無任何感染癥狀［2］。孕婦感染HCMV可引起新生兒宮內(nèi)感染，導(dǎo)致胎兒畸形等嚴(yán)重疾患［3?4］。另外，在免疫功能低下的人群中，例如在艾滋病、器官移植病人中若感染 HCMV 將引起嚴(yán)重的并發(fā)癥［5?6］。目前實驗室檢測HCMV感染的方法有病毒學(xué)檢測、血清學(xué)檢測與核酸檢測等［7］。其中血清學(xué)的檢測是應(yīng)用最普遍的檢測方法，但是由于血清學(xué)檢測的局限性以及臨床應(yīng)用的需要，HCMV核酸檢測逐步開始受到重視。然而最近有關(guān)HCMV檢測的能力驗證報告指出分子診斷缺乏重復(fù)性與可比性，究其原因主要是當(dāng)前缺乏可用的國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［8］。在臨床實驗室檢驗中，采用可靠的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是得到高質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)的前提和保證，也是作出完整科學(xué)結(jié)論的基礎(chǔ)。無論為體外診斷試劑制造商對產(chǎn)品進(jìn)行量值溯源，還是實驗室間的能力驗證（室間質(zhì)評），都離不開HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）、美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）已經(jīng)研制完成HCMV國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，國內(nèi)也開展了相關(guān)的工作。本文對HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制進(jìn)展做簡要概述，旨在為人巨細(xì)胞病毒核酸檢測診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化，以及為其質(zhì)量控制提供參考。

1 HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制進(jìn)展

1.1 WHO國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

目前WHO所研制的大部分核酸類國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是用接近天然的生物材料制備而成。例如有些核酸類國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是將滅活的野生型病毒或者培養(yǎng)物稀釋于人源陰性血清或通用稀釋液，凍干后分裝，按照WHO的固定程序?qū)χ苽涞暮蜻x標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性和均勻性檢驗、多中心合作聯(lián)合定值［9］。WHO制備的國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的表述單位通常為IU（international unit），這種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值是WHO經(jīng)多中心聯(lián)合定值后，確定其可以作為第一個國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后賦予的一個標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值，后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的更替則以第一個標(biāo)準(zhǔn)值為標(biāo)準(zhǔn)繼續(xù)定值。

2008年6月在英國國家生物制品鑒定所（the National Institute for Biological Standards and Con?trol，NIBSC）舉行的基因擴(kuò)增技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化臨床診斷會議上討論了關(guān)于HCMV標(biāo)準(zhǔn)品制劑的建議，對候選原材料和配方進(jìn)行了討論，并且最終確定候選標(biāo)物是包含完整病毒顆粒的HCMV Merlin毒株（NIBSC code 09/162）［10］。Merlin 毒株為 gB1 基因型，與其它實驗室常用HCMV毒株相比，該低傳代株具有良好的HCMV的特征，包含近似于完整的HCMV基因組，且已完全測序（Gene bank登錄號：AY446894）［11］。制備過程主要是將 HCMV Merlin毒株的培養(yǎng)上清樣本在人胚肺成纖維細(xì)胞內(nèi)增殖，收獲培養(yǎng)上清液后先低速離心，然后超速離心收獲病毒沉淀?？紤]到用于HCMV檢測樣本來源的多樣性，候選標(biāo)準(zhǔn)品被溶于通用的緩沖液，該緩沖液含有10 mmol/L的Tris?HCl和0.5%的人血清白蛋白，然后采用各自實驗室所用的樣本基質(zhì)來進(jìn)一步稀釋。最后該制劑經(jīng)過冷凍干燥以確保長期穩(wěn)定。此標(biāo)準(zhǔn)品是通過來自14個國家的32個實驗室進(jìn)行聯(lián)合定值，其中大多數(shù)實驗室都采用實時熒光定量PCR法，最后其量值指定為5×106IU，并被推薦為首個針對HCMV的WHO國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，主要供臨床醫(yī)學(xué)實驗室和體外診斷試劑制造商用于以核酸擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的二次引用HCMV校準(zhǔn)試驗［12］。

1.2 NIST國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

為了建立成分單一且穩(wěn)定供應(yīng)的國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，早在2002年即有專家在WHO會議上提出采用人工合成方法生產(chǎn)國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，隨即開展了一系列相關(guān)研究［13］。其中NIST在HCMV人工合成國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)中取得了很大進(jìn)展。

不同于HCMV?WHO國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，NIST研制的HCMV國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是經(jīng)過提取純化的HCMV基因組DNA。實驗室用毒株在體外培養(yǎng)時常會產(chǎn)生基因序列缺失而導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果，將目的基因連接于質(zhì)粒中會保持基因組的穩(wěn)定［14］。由于HCMV基因組大約235 kb，一般質(zhì)粒載體無法連接，所以NIST研制的HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（SRM2366）是將HCMV基因組通過同源重組方式插入到細(xì)菌人工染色體（bacterial artificialchro?mosome，BAC）上，以產(chǎn)生穩(wěn)定基因組的克隆并且具有低傳染性［15］。SRM2366所用毒株為Towne株，包含了除 IRS1、US1?15、和 UL147 以外相對完整的HCMV基因組。其制備過程主要是將構(gòu)建好的HCMV Towne BAC轉(zhuǎn)入EPI300大腸桿菌中，經(jīng)過培養(yǎng)后收集菌體，再采用堿性裂解法提取純化菌體釋放的BAC DNA，最后將BAC DNA溶于Tris?EDTA（10 mmol/L Tris base，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）通用緩沖液中進(jìn)行分裝。此種制備方法可以持續(xù)獲得穩(wěn)定基因組的核酸標(biāo)準(zhǔn)品。SRM2366的定值不同于WHO采用實時熒光定量PCR的多中心協(xié)作定值，而是采用最新的數(shù)字PCR技術(shù)，此方法不需要線性標(biāo)準(zhǔn)品即可計算出待檢DNA分子的拷貝數(shù)，而且實驗中的探針和引物可以與熒光定量PCR通用。最后，制備的3個水平的HCMV標(biāo)準(zhǔn)品賦值分別為 420 copies/μL，2702 copies/μL，19641 copies/μL，并附有置信水平的不確定度［16］。

1.3 國內(nèi)人巨細(xì)胞病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、質(zhì)控物

隨著HCMV核酸檢測技術(shù)在國內(nèi)臨床實驗室的開展以及《臨床基因擴(kuò)增實驗室工作規(guī)范》的施行，國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)和臨床檢驗實驗室也在探索開發(fā)HCMV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、質(zhì)控物等。在臨床檢驗中HCMV?DNA的定量檢測主要通過尿液、血漿、乳汁等樣本完成，并且由于尿液容易收集，標(biāo)本陽性檢出率較高，而其它標(biāo)本陽性檢出率較低［17］，所以目前國內(nèi)一些臨床實驗室收集HCMV?DNA陽性的患者尿液樣本再經(jīng)過過濾制備成室內(nèi)質(zhì)控物［18］。目前國內(nèi)實驗室制備的室內(nèi)質(zhì)控物一般不添加任何防腐劑與穩(wěn)定劑，這樣可避免基質(zhì)效應(yīng)的不確定影響；并且研究也發(fā)現(xiàn)不加入穩(wěn)定劑與向尿液室內(nèi)質(zhì)控物中加入穩(wěn)定劑（牛血清白蛋白）無明顯差別［19］。但是，此類質(zhì)控物一般只能作為實驗室內(nèi)質(zhì)控，無法像WHO或者NIST制備的HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一樣方便的進(jìn)行更替換代以及量值溯源，在應(yīng)用的過程中也就有所限制，對促進(jìn)HCMV核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)化作用不大，所以國內(nèi)也有些公司或機(jī)構(gòu)研制了可溯源至WHO?HCMV國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，主要用于校準(zhǔn)儀器和裝置、實驗室質(zhì)量控制等，在一定程度上解決了這個問題。

2 HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用

目前，WHO等多個國際組織正在通過廣泛應(yīng)用國際參考物質(zhì)，來證明其在核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)化過程中的實際應(yīng)用價值。其中HCMV核酸國際標(biāo)準(zhǔn)品在其中起到了重要的作用。在實驗室間的能力驗證中，Rychert等［20］應(yīng)用 WHO?HCMV 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來評價各參與實驗室現(xiàn)行的HCMV核酸檢測方法，結(jié)果顯示W(wǎng)HO?HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)促進(jìn)了HCMV檢測的標(biāo)準(zhǔn)化并且各實驗室數(shù)據(jù)具有可比性。HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還應(yīng)用于產(chǎn)品的溯源、儀器的評價和校準(zhǔn)等。目前羅氏、雅培等體外診斷試劑制造廠商的校準(zhǔn)品均溯源至WHO?HC?MV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并顯示了良好的一致性，不過各檢測系統(tǒng)的靈敏度仍然具有差異［21］。Tsai等［22］也應(yīng)用WHO?HCMV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來對不同HCMV核酸檢測系統(tǒng)的性能特征、相關(guān)性和工作流程等進(jìn)行評價。而且隨著數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用，為了評價熒光定量PCR和數(shù)字PCR等不同平臺在核酸定量檢測中的性能，Pav?i?等［23?24］分別應(yīng)用 WHO 和 NIST研制的2種核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行試驗，結(jié)果表明數(shù)字PCR受到不同組成的PCR反應(yīng)組分所產(chǎn)生的影響更小，并且在檢測臨床血漿樣本中HCMV時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒DNA載量≥4 log10時數(shù)字PCR的精密度明顯高于熒光定量PCR的精密度。

在HCMV核酸以及其它核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的廣泛應(yīng)用的過程中也出現(xiàn)了一些問題，例如，核酸提取效率的問題。例如，WHO和NIST研制的HCMV核酸國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方法不同，SRM2366國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為人工構(gòu)建具有基本完整的病毒基因組，并且低傳染性，但類似于此類的合成的核酸未參與核酸提取過程，故不能反映病毒核酸的提取效率；同時，國際參考物質(zhì)在于提供一個準(zhǔn)確的數(shù)值，而不是關(guān)注提取效率，因此在制備國際參考物質(zhì)的時候是否需要考慮提取過程還有待討論。另外，HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互換性也需要注意?；Q性為不同檢測系統(tǒng)對某個參考物質(zhì)和來自健康或疾病個體代表樣品的檢測所得的結(jié)果量值一致，即各個樣品或參考物質(zhì)的檢測值可以在不同檢測系統(tǒng)間互換［25］。例如，Hayden 等［26］在研究HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互換性時發(fā)現(xiàn)，通過8家實驗室采用10種不同的熒光定量PCR檢測WHO?HCMV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與50份臨床樣本，通過線性回歸和對應(yīng)分析WHO?HCMV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互換性，發(fā)現(xiàn)在此分析方法下WHO?HCMV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)互換性較差。并且HCMV核酸國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同基質(zhì)中也會有影響，Jones等［27］研究表明使用全血稀釋W(xué)HO?HCMV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，全血稀釋的WHO?HCMV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行HCMV全血定量測定校正試驗時，樣本的測量濃度值會偏高。然而使用血漿或通用緩沖液對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行稀釋時無基質(zhì)效應(yīng)出現(xiàn)；而SRM2366國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，雖然不需要對其進(jìn)行提取，但是在實驗中采用血漿或者全血作為稀釋液進(jìn)行稀釋后，于臨床樣本一同進(jìn)行測量結(jié)果顯示互通性良好。

小結(jié)

隨著HCMV相關(guān)疾病研究的深入，HCMV的危害越來越受到重視。與其它方法相比，核酸水平的檢測更為簡便、可靠，并且可以做到早期檢測及量化，對判斷HCMV的活動性和評價抗病毒治療療效的動態(tài)監(jiān)測有著重要的意義。而相應(yīng)國際標(biāo)準(zhǔn)品建立工作也在不斷推進(jìn)，已存在的WHO和NIST的HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在一定程度上促進(jìn)了HCMV檢測以及核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)然，在推動HCMV核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)化中也遇到了很多問題，例如上文中提到的核酸提取效率問題，所以更需要推動核酸檢測的全自動化以減少手動提取核酸的誤差。并且目前國內(nèi)市場上存在著大約10家HCMV核酸診斷試劑生產(chǎn)廠家，由于國內(nèi)還缺乏可靠的HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，所以大部分市售的HCMV核酸檢測試劑的標(biāo)準(zhǔn)化還存在問題，這也就更需要相關(guān)機(jī)構(gòu)去努力研制出可靠的HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以促進(jìn)核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，為臨床準(zhǔn)確診斷提供合理依據(jù)。

［1］ Smith AJ，Weidman F.Infection of a stillborn infant by an amoebiform protozoon［J］.Univ Penn Med Bull，1910，23：285?298.

［2］ 余鐘聲，鄭季彥，陳黎勤，等.嬰兒人巨細(xì)胞病毒感染病原學(xué)和臨床分析［J］.中華傳染病雜志，2006，24（5）：333?337.

［3］ 陸念英.小兒巨細(xì)胞病毒感染的臨床診治研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)理論與實踐，2016，29（14）：1865?1867.

［4］ Emery VC.Cytomegalovirus：recent progress in under?standing pathogenesis and control［J］.QJM，2012，105（5）：401?405.

［5］ 鄭麗麗，楊亞培.人巨細(xì)胞病毒感染及免疫機(jī)制研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（11）：2114?2117.

［6］ Le Page AK，Jager MM，Kotton CN，et al.Interna?tional survey of cytomegalovirus management in solid organ transplantation after the publication of consensus guidelines［J］.Transplantation，2013，95（12）：1455?1460.

［7］ 唐華.人巨細(xì)胞病毒感染的實驗室診斷技術(shù)研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（3）：383?386.

［8］ Pang XL，F(xiàn)ox JD，Preiksaitis JK，et al.Inter?labora?tory comparison of cytomegalovirus（CMV）viral load（VL）assays［J］.Am J Transplant，2009，9（2）：258?268.

［9］ World Health Organization.Annex 2：recommenda?tions for the preparation，characterization and establish?ment of international and other biological reference standards（revised 2004）［J］.Who Technical Report，2005.

［10］ Fryer JF，Minor PD.Standardisation of nucleic acid amplification assays used in clinical diagnostics：a re?port of the first meeting of the SoGAT Clinical Diag?nostics Working Group［J］.J Clin Virol，2009，44（2）：103?105.

［11］ Wilkinson GW，Davison AJ，Tomasec P，et al.Hu?man cytomegalovirus：taking the strain［J］.Med Mi?crobiol Immunol，2015，204（3）：273?284.

［12］ Fryer JF，Heath AB，Anderson R，et al.Collaborative study to evaluate the proposed 1st［first］WHO interna?tional standard for human cytomegalovirus（HCMV）for nucleic acid amplification（NAT）?based assays［J］.Journal of Staff Development，2010，34（1）：36?39.

［13］ 王雪亮，肖艷群，王華梁，等.分子診斷相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（2）：125?129.

［14］ Isa M，Wilkie GS，Davison AJ，et al.Genetic stabili?ty of bacterial artificial chromosome?derived human cy?tomegalovirus during culture in vitro［J］.J Virol，2016，90（8）：3929?3943.

［15］ Paredes AM，Yu D.Human cytomegalovirus：bacteri?al artificial chromosome（BAC）cloning and genetic manipulation［J］.Curr Protoc Microbiol，2012，14：14E.4.

［16］ Haynes RJ，Kline MC，Toman B，et al.Standard ref?erence material 2366 for measurement of human cyto?megalovirus DNA［J］.J Mol Diagn，2013，15（2）：177?185.

［17］ 高培杰，賴惠英，傅清流.熒光定量PCR檢測巨細(xì)胞病毒感染的標(biāo)本選擇［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（10）：2149?2151.

［18］ 陳克平，徐玉蓉，李麗.人巨細(xì)胞病毒核酸定量熒光PCR檢測的尿液室內(nèi)質(zhì)控物制備［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2015，35（11）：1766?1769.

［19］ 蔡桂君，林麗娟，方艷平，等.自制人巨細(xì)胞病毒核酸室內(nèi)質(zhì)控物的重復(fù)性觀察［J］.臨床檢驗雜志，2013（9）：713?714.

［20］ Rychert J，Danzigerisakov L，Yenlieberman B，et al.Multicenter comparison of laboratory performance in cytomegalovirus and epstein?barr virus viral load test?ing using international standards［J］.Clin Transplanta?tion，2014，28（12）：1416?1423.

［21］ Schnepf N，Scieux C，Resche?Riggon M，et al.Fully automated quantification of cytomegalovirus（CMV）in whole blood with the new sensitive Abbott real?time CMV assay in the era of the CMV international stan?dard［J］.J Clin Microbiol，2013，51（7）：2096?2102.

［22］ Tsai HP，Tsai YY，Lin IT，et al.Comparison of two commercial automated nucleic acid extraction and inte?grated quantitation real?time PCR platforms for the de?tection of cytomegalovirus in plasma［J］.Plos One，2016，11（8）：e0160493.

［23］ Pav?i? J，?el J，Milavec M.Assessment of the real?time PCR and different digital PCR platforms for DNA quantification［J］.Anal Bioanal Chem，2016，408（1）：107?121.

［24］ Sedlak RH，Cook L，Cheng A，et al.Clinical utility of droplet digital PCR for human cytomegalovirus［J］.J Clin Microbiol，2014，52（8）：2844?2848.

［25］ 馮仁豐.互換性依然是問題［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2013（12）：1063?1068.

［26］ Hayden RT，Preiksaitis J，Tong Y，et al.Commutabili?ty of the first world health organization international standard for human cytomegalovirus［J］.J Clin Microbi?ol，2015，53（10）：3325?3333.

［27］ Jones S，Webb EM，Barry CP，et al.Commutability of cytomegalovirus WHO international standard in differ?ent matrices［J］.J Clin Microbiol，2016，54（6）：1512?1519.

The development and application of reference materials for human cytomegalo?virus nucleic acids

FU Yue1,WANG Ruixia1,ZOU Yingshu1,LI Erhua2,GAO Xunian2,WANG Jun1★
(1.Beijing Key Laboratory of Medical Device Testing and Safety Evaluation,Beijing Institute of Medical Device Testing,Beijing,China,101111;2.Guangzhou Bangdesheng Biological Technology Co.,Ltd,Guangzhou,Guangdong,China,510665)

Human cytomegalovirus(HCMV)is one of the most important pathogens which are threatening people health in the world.With the development of molecular biology techniques,value of HCMV DNA detection has been recognized gradually.The reference materials for HCMV test are critical to guarantee the quality of the test.In this study,the research progress of the reference materials for HCMV nucleic acid amplification testing and the problems in application will be summarized.The aim of this study was to standardize the diagnostic reagents for human cytomegalovirus nucleic acid testing and provide a reference for the quality control.

Human cytomegalovirus;Nucleic acid;Reference materials

北京市科技計劃課題（Z151100002115047）

1.北京市醫(yī)療器械檢驗所，醫(yī)療器械檢驗與安全性評價北京市重點(diǎn)實驗室，北京101111

2.廣州邦德盛生物科技有限公司，廣東，廣州510665

★通訊作者：王軍，E?mail：wangjun1@bimt.org.cn