董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

肉桂水提取物對(duì)重型顱腦損傷大鼠腦細(xì)胞凋亡、IL-6的影響

董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

目的：通過(guò)觀察肉桂水提取物對(duì)重型顱腦損傷大鼠腦細(xì)胞凋亡、血清白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6的影響，探討肉桂對(duì)重型顱腦損傷腦組織的保護(hù)作用。方法：54只SD大鼠隨機(jī)分為三組，根據(jù)Feeney′s自由落體打擊造模法復(fù)制動(dòng)物模型。于傷后6h灌胃。灌胃后24h、72h、168h分別通過(guò)TUNEL法、ELISA法檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡、血清IL-6的含量。結(jié)果：（1）重型顱腦損傷大鼠受傷后血清IL-6明顯升高，持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在72h明顯加重血清IL-6的升高，而在168h可以抑制血清IL-6的升高。（2）重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細(xì)胞凋亡，這種凋亡一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在72h明顯加重這種凋亡，而在168h可以改善腦細(xì)胞凋亡。其作用與IL-6的含量相關(guān)。結(jié)論：肉桂水提取物對(duì)重型顱腦損傷早期用藥會(huì)加劇炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，三天后用藥則呈現(xiàn)明顯的保護(hù)作用。

肉桂；重型顱腦損傷；腦細(xì)胞凋亡；IL-6

中藥肉桂系樟科植物肉桂的干燥樹(shù)皮，性辛、甘、大熱，歸腎、肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛，溫通經(jīng)脈等功能；主要用于陽(yáng)虛、寒凝瘀滯等病癥的治療[1]。當(dāng)代有人發(fā)現(xiàn)，肉桂水提液對(duì)非創(chuàng)傷性缺血性腦損傷具有一定的保護(hù)作用[2]，可以通過(guò)提高神經(jīng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)慢性腦缺血后腦組織損傷修復(fù)過(guò)程[3]。然而這些研究主要是觀察肉桂對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用，對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷的保護(hù)作用還未見(jiàn)研究報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)炎癥反應(yīng)介質(zhì)IL-6和細(xì)胞凋亡等指標(biāo)，觀察肉桂對(duì)重型顱腦損傷腦組織修復(fù)的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1 主要藥品、試劑及儀器

肉桂（產(chǎn)于廣西）購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房；TUNEL試劑盒購(gòu)自于Roche公司； ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司，編號(hào)∶ERC003。改良的Feeney’s 自由落體打擊裝置；Multiskan FC酶標(biāo)儀（塞默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn)）；高速冷凍離心機(jī)（英國(guó)生產(chǎn)，型號(hào)：英泰TDL5M）；正置熒光相差顯微成像鏡（型號(hào)：BΧ53+DP73+cellsens）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量（230±20）g，購(gòu)自于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)∶SCΧK(桂)2014-0002。SD大鼠隨機(jī)分成A組（正常對(duì)照組）﹑B組(模型組)﹑C組（肉桂水提取物組）三組，每組各18只。給藥組在造模后6h予肉桂水提取物灌胃，劑量用成人每日常用量5g，換算成大鼠劑量，計(jì)算方法依據(jù)徐淑云藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)公式計(jì)算【劑量=(成人的用量×換算系數(shù)0.018×3.16倍)/2】，正常對(duì)照組與模型組分別在傷后6h以等量生理鹽水灌胃，各組灌胃均每日1次，連續(xù)7天。

1.3 重型顱腦損傷模型制備

根據(jù)文獻(xiàn)[4]建立模型。于造模6h后，參照有相關(guān)文獻(xiàn)[5]對(duì)每只動(dòng)物行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]，采用10 分制、單盲法進(jìn)行評(píng)分；＞2 分則說(shuō)明造模成功，＜2 分則剔除。

1.4 標(biāo)本采集及檢測(cè)

1.4.1 標(biāo)本采集

各組分別在造模后第24、72、168h三個(gè)時(shí)間段取材，每組每個(gè)時(shí)間段隨機(jī)取6只大鼠。（1）以心臟采血法采血3mL，4℃，2200 r/min離心15min，取上清液，置-80℃冰箱待測(cè)IL-6。（2）經(jīng)升主動(dòng)脈灌注250mL的0.9%氯化鈉注射液，直至從右心房流出的液體變清亮為止，再灌注4%多聚甲醛液250mL，斷頭取腦，并迅速浸入4%多聚甲醛液中，固定24h后修成4mm塊，常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋待測(cè)腦細(xì)胞凋亡。

1.4.2 腦細(xì)胞凋亡檢測(cè)

以TUNEL原位法檢測(cè)損傷區(qū)凋亡細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行檢測(cè)。每組6只大鼠分別選同一冠狀層的切片在高倍鏡下觀察，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色的為陽(yáng)性細(xì)胞，8 個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞，計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+ 陰性細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4.3 血清IL-6檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)。最后使用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)按順序測(cè)量各孔的濃度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

表1：各組血清IL-6含量（±s，pg/ml）

表1：各組血清IL-6含量（±s，pg/ml）

與A組比較，#P＜0.05；與同時(shí)間段B組比較，*P＜0.05；與同組168h比較，△P＜0.05

組別N24h72h168h A組1851.03 ±23.7651.02 ±24.3650.03 ±13.76 B組18142.23±52.32#126.53±34.74#102.82±34.50# C組18141.67±6.99#△275.80± 98.67#*△60.09±17.65*

表2：各組腦組織TUNEL細(xì)胞凋亡率（±s，%）

表2：各組腦組織TUNEL細(xì)胞凋亡率（±s，%）

與A組比較，#P＜0.05；與同時(shí)間段B組比較，*P＜0.05；與同組168h比較，△P＜0.05

組別N24h72h168h A組189.44 ± 2.8610.05± 3.1210.25± 2.90 B組1874.75±10.13#68.55±11.46#68.23± 5.46# C組1872.84±6.90#△81.14± 6.86#*△39.74± 12.26#*

2.1 血清IL-6含量

結(jié)果見(jiàn)表1。B、C組與A組比較，血清IL-6含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組在72h與B組比較，C組IL-6含量明顯高于B組。C組在168h與B組比較，C組IL-6含量明顯低于B組。C組在168h時(shí)間段與24h、72h兩個(gè)時(shí)間段比較有差異。B組各時(shí)間段比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。這些結(jié)果提示，重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6明顯升高，一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在24h無(wú)變化，在72h血清IL-6水平明顯升高，而在168h血清IL-6水平明顯下降，接近正常組水平。

2.2 腦組織TUNEL細(xì)胞凋亡率

結(jié)果見(jiàn)表2。B、C組與A組比較，腦細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組在72h與B組比較，C組明顯高于B組。C組在168h與B組比較，C組明顯低于B組。C組在168h時(shí)間段與24h、72h兩個(gè)時(shí)間段比較有差異。B組各時(shí)間段比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。這些結(jié)果提示，重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細(xì)胞凋亡，這種凋亡一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在24h凋亡無(wú)變化，在72h凋亡加重，而在168h腦細(xì)胞凋亡則比模型組明顯下降。

2.3 血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡的關(guān)系

結(jié)果見(jiàn)圖1。C 組血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡率相關(guān)關(guān)系Pearson 的系數(shù)r = 0.816，P = 0.000（雙側(cè)）。其他各組血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡率無(wú)相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示C組血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡率有正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

重型顱腦損傷早期都存在繼發(fā)炎癥反應(yīng)，這一炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷的主要機(jī)制之一[7，8]。IL-6 在炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，Marklund等人[9]認(rèn)為IL-6在損傷發(fā)生后即刻就上升，而且損傷程度越嚴(yán)重，血中IL-6的含量就越高，IL-6含量與腦損傷程度呈正比。本研究發(fā)現(xiàn)，重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6即明顯升高，這一現(xiàn)象一直持續(xù)至第168h。結(jié)果與Marklund等人的研究結(jié)果基本一致。說(shuō)明顱腦損傷后一周內(nèi)一直存在明顯的炎癥反應(yīng)。用肉桂水提取物干預(yù)后，在72hIL-6水平比模型組明顯升高，而在168h IL-6水平則明顯降低，接近正常水平。這說(shuō)明顱腦損傷早期（72h內(nèi)）用藥，肉桂會(huì)加劇顱腦損傷的炎癥反應(yīng)，從而加重腦組織損傷。而72h后用藥則能夠抑制顱腦損傷的炎癥反應(yīng)，呈現(xiàn)保護(hù)腦細(xì)胞的作用。

研究表明，顱腦損傷導(dǎo)致的腦細(xì)胞損害除了直接損傷引起的腦細(xì)胞死亡外，還存在繼發(fā)的細(xì)胞凋亡[10-12]。張劍濤[13]等人報(bào)道顱腦損傷傷灶周圍額皮質(zhì)在4h后即開(kāi)始出現(xiàn)腦細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，以后凋亡細(xì)胞逐漸增加，至3d達(dá)高峰，之后有所下降。腦細(xì)胞凋亡的原因很多，但顱腦損傷繼發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是重要原因之一。實(shí)驗(yàn)中觀察到，重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細(xì)胞凋亡，一直持續(xù)到168h。用肉桂干預(yù)后，腦細(xì)胞凋亡在早期明顯加劇，而在72h后明顯減少細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)與炎癥反應(yīng)重要指標(biāo)IL-6水平的變化趨勢(shì)基本一致。這表明顱腦損傷早期用藥，肉桂會(huì)加劇炎癥反應(yīng)，以致加重腦細(xì)胞的凋亡，而72h后用藥則可以抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕腦細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)腦細(xì)胞的作用。

肉桂對(duì)顱腦損傷炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制還不是很清楚?？赡芘c肉桂通過(guò)抑制炎癥因子降低腦水腫有關(guān)。細(xì)胞因子炎癥反應(yīng)可加重腦水腫、腦組織缺氧使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)一步遭受損害[14]。有人發(fā)現(xiàn)肉桂水提物通過(guò)減輕缺血區(qū)腦組織水腫而明顯降低腦含水量，而對(duì)缺血性腦損傷具有一定的保護(hù)作用[2]。楊小鋒[15]等人提出，腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)與顱內(nèi)壓、腦組織含水量在不同時(shí)期呈正相關(guān), 在總體的變化過(guò)程中也有正相關(guān)性。

圖1

（通訊作者：潘宇政）

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國(guó)家自然科學(xué)基金（NSFC.81460687），廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)（GZLC14-29）。

董菲菲（1990-），女，碩士研究生。

潘宇政（1961-），男，碩士生導(dǎo)師。