鄒邦興 周安蓮 肖文福 張友洪 肖金樹

家蠶微粒子檢測新方法的探索

鄒邦興 周安蓮 肖文福 張友洪 肖金樹

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000）

目前，蠶種質(zhì)檢單位在微粒子檢測上都沿用巴斯德提出的母蛾顯微鏡檢法，而該方法的使用在很大程度上取決于鏡檢人員的操作技能、專業(yè)判斷、業(yè)務(wù)素質(zhì)及設(shè)備情況，其檢測結(jié)果與人員的操作息息相關(guān)。因此，當(dāng)下能否找到一種實(shí)用、簡單、對人員要求低、高效快速的新方法值得蠶業(yè)工作者去探索。

蠶種 微粒子檢測 方法

蠶桑行業(yè)在我國有著幾千年的歷史底蘊(yùn)，封建社會時期栽桑養(yǎng)蠶成為養(yǎng)蠶農(nóng)家的主要經(jīng)濟(jì)來源，然而隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國的蠶桑行業(yè)受到極大影響。從20世紀(jì)90年代開始，蠶桑行業(yè)逐年下滑，其中主要的因素是勞動力外出和蠶病危害，尤以微粒子病破壞嚴(yán)重。根據(jù)巴斯德的研究，家蠶微粒子病的病原是原生動物中的家蠶微粒子蟲，在顯微鏡下觀察其孢子一般為卵圓形，呈淡綠色，有折光性（如圖1）。微孢子由孢子壁，極膜層，極絲，孢原質(zhì)和后極泡組成［1］。此外還發(fā)現(xiàn)微粒子是唯一可以通過母蛾胚胎傳播給下一代的蠶病。為了避免該病的發(fā)生，每年蠶種生產(chǎn)單位都必須對產(chǎn)卵母蛾對號入座進(jìn)行顯微鏡檢查，將帶毒的母蛾所產(chǎn)下的蠶卵按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定嚴(yán)格淘汰，保證蠶種健康。顯微鏡檢法多年來一直為各國蠶桑行業(yè)用來檢疫微粒子病的有效途徑，其效果也是有目共睹的。該方法的使用主要依靠鏡檢人員對每個玻片觀察5至10個左右視野來判斷母蛾是否帶毒而進(jìn)行淘汰，因此蠶種檢測工作對鏡檢人員的操作技能、專業(yè)判斷、業(yè)務(wù)素質(zhì)及設(shè)備情況要求很高，而這些人為因素和客觀條件都有可能造成我們在鏡檢環(huán)節(jié)中把帶毒不合格蠶卵當(dāng)成健康蠶卵投放到生產(chǎn)上去，從而給蠶業(yè)行業(yè)帶來災(zāi)難性破壞。

圖1 顯微鏡檢下的微孢子

1 當(dāng)前母蛾鏡檢中存在的問題

1.1 鏡檢視野是否不足

目前鏡檢單位通常按蠶種分類來制定鏡檢標(biāo)準(zhǔn)：對于一代雜交種，其鏡檢視野一般在5至10個左右，如果觀察的視野中沒發(fā)現(xiàn)微粒子孢子，我們可以初步判定該母蛾不帶毒，其產(chǎn)下的蠶卵也就表示健康，待按標(biāo)準(zhǔn)抽取對應(yīng)批次蠶卵催青后對蟻蠶進(jìn)行檢驗(yàn)檢疫后方可最終確定該批蠶種是否可以投入生產(chǎn)使用；對于原種、原原種的檢驗(yàn)，我們則更為嚴(yán)格，采取對檢方法，每各玻片通常觀察10個視野。無論是一代雜交種還是原種、原原種的檢驗(yàn)，都是需要耗費(fèi)大量人力，且檢驗(yàn)過程也相對繁瑣。每年的蠶種檢測工作時間比較集中，工作量大，我們的檢測人員長時間在顯微鏡下觀看，難免會出現(xiàn)視野不足，從而不能全面判斷。同時，有的玻片里面微粒子孢子較少，不易發(fā)現(xiàn)，檢測人員個人原因就有可能把帶毒的蠶種誤判為健康蠶卵，從而讓其流入生產(chǎn)。這也解釋了我們每年進(jìn)行嚴(yán)格的蠶種檢測與淘汰，而微粒子依然存在的原因（當(dāng)然這其中不乏養(yǎng)蠶過程中遭到微粒子的入侵，但是也不能否認(rèn)蠶卵自身帶微粒子）。

1.2 根據(jù)帶毒率進(jìn)行蠶種淘汰

目前蠶種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的有毒淘汰率比較嚴(yán)格，若原種檢測出有毒母蛾數(shù)在全部母蛾數(shù)中超過2‰這一比例，則整批原種就必須淘汰；對于一代雜交種，則按有毒母蛾集團(tuán)數(shù)不超過5‰為淘汰標(biāo)準(zhǔn)。這種寧錯勿放的原則給制種單位帶了極大挑戰(zhàn)，本來生產(chǎn)的一批原種中只有幾個蛾區(qū)檢測出帶毒，而這一比例剛好超過2‰，都必須把這批蠶種中健康的蠶種全部一起銷毀，這不僅是一種資源浪費(fèi)，而且對制種單位來講更是耗材耗力。

1.3 對人員要求高

我們的微粒子孢子鏡檢工作主要是通過專業(yè)人員對鏡檢區(qū)域觀察，然后判定我們的樣品是否帶毒，而這一環(huán)節(jié)與檢測人員專業(yè)操作技能、專業(yè)判斷、業(yè)務(wù)素質(zhì)有很大關(guān)聯(lián)。因此母蛾顯微鏡檢對人員要求極高，不僅要求檢測人員要有豐富的理論知識，而且還需具備多年鏡檢經(jīng)驗(yàn)。在當(dāng)前從事蠶桑行業(yè)的各個單位，專業(yè)新生力量缺乏，人員結(jié)構(gòu)不合理，急需大量的專業(yè)人才加入來充實(shí)行業(yè)隊(duì)伍。

2 微粒子檢測新方法的發(fā)展探索

當(dāng)前科學(xué)技術(shù)發(fā)達(dá)，我們可以充分利用科學(xué)技術(shù)帶來的便利，找到一種高效、快速、檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤、檢測靈敏度高的新方法來取代母蛾顯微鏡檢法。對于微粒子檢測新方法的探索，本文主要從以下三個方向闡述目前在微粒子檢測中研發(fā)的新方法、新技術(shù)。

2.1 試紙顯色檢驗(yàn)法

該方法目前在很多檢測領(lǐng)域都有使用，其特點(diǎn)是快速、高效、易鑒別、且檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤，最明顯的例子就是pH試紙?jiān)跈z測液體酸堿性方面的使用，根據(jù)所取樣本在試紙上的顯色情況，在酸堿顯色圖上對比顏色就能簡單判斷該樣本液體的pH值大小。同理我們也可以根據(jù)微粒子孢子的結(jié)構(gòu)分析，找到其中一種物質(zhì)能夠用顯色反應(yīng)來來鑒定，然后制作試紙，在檢測微粒子孢子時只需要把母蛾研磨，取一滴研磨液置于試紙上，如有顯色則判定為該母蛾帶毒，對應(yīng)淘汰所產(chǎn)蠶卵。這種方法在使用上省時省力，操作簡單，對人員要求不高，符合當(dāng)前檢種需要，而且檢測結(jié)果比顯微鏡檢法可靠。目前已有報道的是微粒子試紙檢測研究｛2｝，只是該研究中使用的試紙對檢測的微粒子顯色較淺，不容易觀察，但是至少證實(shí)了該方法可以在家蠶微粒子診斷上得到應(yīng)用。

2.2 熒光染色法

劉吉平［3］等探討了應(yīng)用熒光染色劑CalcofluorWhiteM2R鑒別微孢子，結(jié)果證明在顯微鏡下微孢子被染上青藍(lán)色熒光，而寄主的組織碎片、病毒、細(xì)菌等均不被染色，具有高度特異性。但該方法只局限于實(shí)驗(yàn)室使用，因?yàn)樗鼘Σ僮髟O(shè)備要求高，對于生產(chǎn)檢測尚無法投入。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

2.3 PCR檢測技術(shù)

目前有報道的關(guān)于使用PCR技術(shù)在微粒子檢測上的研究有許多，如魯興萌［4］等應(yīng)用PCR在微粒子檢測應(yīng)用中的研究；劉駿［5］等應(yīng)用PCR試劑盒診斷微粒子等。這些新興方法的研究確實(shí)能夠檢測出微粒子，但其不足之處在于應(yīng)用PCR技術(shù)檢測微孢子的問題主要集中在檢測的靈敏度不高、特異性不夠及成本高等，由此限制了PCR技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，不過這也為今后的檢測方法指明了一個方向。

3 討論

傳統(tǒng)的顯微鏡檢法雖然是當(dāng)前各蠶種檢驗(yàn)單位主要的檢測方法，但是經(jīng)過多年使用，其存在的問題也越來越多。為了有效解決當(dāng)前母蛾鏡檢法中存在的不足，確保在檢查過程中做到檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤，我們有必要找到一種高效、快速、省時省力的新方法來代替母蛾顯微鏡檢法。新方法的使用必須具備高效快速、檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤、操作簡單、對人員不高，同時也省時省力，符合目前蠶種生產(chǎn)檢驗(yàn)需求。文中提到的三個方向均是在實(shí)驗(yàn)室條件下應(yīng)用研究的，具體落實(shí)在生產(chǎn)上還需大量研究，其中試紙顯色檢測法最有可能成為今后取代母蛾顯微鏡檢法的一種新技術(shù)，相比其他兩種方法，試紙顯色檢測具備操作簡單、高效快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，相信經(jīng)過全國蠶桑行業(yè)從業(yè)人員共同努力，新方法、新技術(shù)終究會有來臨的一天。

［1］金偉.家蠶病理學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：148－150.

［2］蘆琨.家蠶微粒子病免疫學(xué)快速檢測試紙條的研制［D］.［碩士學(xué)位論文］.重慶：西南大學(xué)，2009.

［3］劉吉平，曾玲.CalcofluorWhiteM2R熒光染色法識別家蠶微孢子蟲［J］.昆蟲學(xué)報，2007，50（11）：1185－1186.

［4］魯興萌，李光才，孟祥坤等.家蠶微粒子病的PCR檢測技術(shù)研究與應(yīng)用［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（5）；0878－0882.

［5］劉駿，錢科，沈中元.家蠶微粒子病PCR快速檢測技術(shù)研究及診斷試劑盒的研制［J］.中國動物檢疫，2009，26（10）：49.

鄒邦興（1989－），男，本科，研究實(shí)習(xí)員，主要從事家蠶品種選育及推廣。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（蠶桑）專項(xiàng)；四川省“十三五”農(nóng)作物育種攻關(guān)項(xiàng)目；四川省“十三五”財政創(chuàng)新能力提升工程專項(xiàng)。