王長遠(yuǎn)，馮玉超，陳光輝，于長青，徐，姚 笛，李志江，錢麗麗

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江農(nóng)墾英博華威乳業(yè)有限公司，黑龍江伊春 153000）

一種植物乳桿菌緩釋微膠囊的體外穩(wěn)定性分析

王長遠(yuǎn)1，馮玉超1，陳光輝2，于長青1，徐1，姚 笛1，李志江1，錢麗麗1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江農(nóng)墾英博華威乳業(yè)有限公司，黑龍江伊春 153000）

檢測一種自行制備的植物乳桿菌緩釋微膠囊的體外穩(wěn)定性。模擬胃腸液環(huán)境分析其耐受性，并比較不同溫度下的貯藏穩(wěn)定性及降膽固醇性能。經(jīng)人工胃液處理3 h后，凍干微膠囊中的活菌數(shù)達(dá)到75%；經(jīng)人工腸液處理3 h后，微膠囊中活菌數(shù)仍有70%；于-20℃條件下貯藏的微膠囊活菌數(shù)量最多，6個(gè)月后仍可達(dá)5.8×108CFU/g；包埋后植物乳桿菌的膽固醇降解率為25.73%。結(jié)果表明，微膠囊化的壁材對植物乳桿菌起到了很好的保護(hù)作用，體外穩(wěn)定性較好。

植物乳桿菌；緩釋微膠囊；穩(wěn)定性分析；膽固醇

隨著膳食結(jié)構(gòu)的改變，過量攝入食物中膽固醇所導(dǎo)致的心腦血管疾病已成為人們關(guān)注的重要問題[1]。近年來，人們對益生菌的認(rèn)識(shí)不斷加深，而作為益生菌的一種，以降低膽固醇作用為主的植物乳桿菌所具有的保健作用也逐步得到認(rèn)可，相關(guān)植物乳桿菌產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用也同樣受到食品行業(yè)的廣泛關(guān)注[2-4]。

但是，植物乳桿菌隨口進(jìn)入機(jī)體后，在體內(nèi)會(huì)經(jīng)受消化道的胃酸、膽汁酸及消化酶等因素的影響，大大降低了能夠進(jìn)入腸道內(nèi)定植并發(fā)揮其益生功效的活菌數(shù)。微膠囊技術(shù)被廣泛用于生產(chǎn)益生菌制劑，將乳酸菌包埋能夠在一定程度上提高乳酸菌對外界不利條件的耐受性，使其能夠順利通過胃部到達(dá)腸道，并在腸道內(nèi)發(fā)揮功效[5-7]。微膠囊技術(shù)可以增強(qiáng)物質(zhì)的穩(wěn)定性，并能很好地改善微生物在食品和腸道內(nèi)的生存能力[8]。試驗(yàn)以海藻酸鈉-殼聚糖作為壁材對植物乳桿菌進(jìn)行包埋[9]，并對所制備的植物乳桿菌緩釋微膠囊模擬胃腸液耐受性，以及不同溫度下的貯藏穩(wěn)定性、降膽固醇性能進(jìn)行研究，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌M1-UVs29，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室選育和保藏，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)該菌株具有降膽固醇能力[10]。

1.1.2 試劑

MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、膽固醇、豬膽鹽，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胃蛋白酶，購自美國Sigma公司；硫酸鐵銨，購自沈陽市華東試劑廠；胰蛋白酶，購自深圳恒生生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

Specord210 plus型紫外分光光度儀，德國耶拿分析儀器股份公司產(chǎn)品；TD5A型滅菌鍋，長沙英泰儀器有限公司產(chǎn)品；Forma-86c型超低溫冰箱，美國Thermo公司產(chǎn)品；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；Alpha 1-2 LDplus型真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司產(chǎn)品；DZG-6000型真空干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要溶液配制

人工胃液、人工腸液、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)使用液等溶液，按照參考文獻(xiàn)[10]中方法配制。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌緩釋微膠囊的制備

按照參考文獻(xiàn)[9]中方法制備。

1.2.2 胃液耐受性試驗(yàn)

按照不同制備工藝條件制備的新鮮微膠囊和凍干微膠囊，并利用實(shí)驗(yàn)室自制的菌粉為對照，分別稱取1 g加入到裝有人工胃液的試管中，置于37℃，轉(zhuǎn)速100 r/min水浴搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在0，1，2，3 h后取出，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集沉淀物，放入pH值為7.4的PBS緩沖溶液中，于37℃條件下振蕩至完全崩解，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3 腸液耐受性試驗(yàn)

將經(jīng)人工胃液處理3 h后的未溶解微膠囊過濾洗滌，收集微膠囊，分別加入到裝有人工腸液的試管中，置于37℃，轉(zhuǎn)速100 r/min的水浴搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)，同胃液耐受性試驗(yàn)方法。

1.2.4 貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

將制備好的微膠囊裝于小玻璃瓶中，密封，分別放置于-20，4，25℃環(huán)境中，分別于0，1，2，3，4，5，6個(gè)月取樣，測定其活菌數(shù)。

1.2.5 37℃貯藏性試驗(yàn)

將制備好的微膠囊裝于小玻璃瓶中，密封，放置于37℃條件下貯藏，分別于0，15，30，45，60 d取樣，測定其活菌數(shù)，與密封同時(shí)制備好的菌粉作對照。

1.2.6 降膽固醇性能測定

（1）膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。吸取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)使用液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL分別置于10 mL試管內(nèi)，在各試管內(nèi)加入冰乙酸使總體積達(dá)4 mL。加入2 mL鐵礬顯色液，注意要延管壁緩慢加入。加完后再充分振搖混勻，在15~90 min內(nèi)，于波長560 nm處測比色。以膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）膽固醇降解率的測定方法。將菌粉和制備好的微膠囊接種到20 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下靜置培養(yǎng)20 h。將活化好的菌種以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的接種量接種到20 mL高膽固醇MRSO-CHOL培養(yǎng)基中，在37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。經(jīng)降解后的液體以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，得到的上清液用于測定膽固醇含量，計(jì)算膽固醇降解率。

式中：M0——對照液中膽固醇質(zhì)量濃度，μg/mL；

M1——試驗(yàn)上清液的膽固醇質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.2.7 人工胃腸液處理后菌體存活率的測定

測定微膠囊經(jīng)人工胃腸液處理前后的活菌總數(shù)，并計(jì)算存活率。

式中：A——人工胃腸液處理前1 g樣品的活菌數(shù)，CFU/g；

B——人工胃腸液處理后1 g樣品的活菌數(shù)，CFU/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃液耐受性試驗(yàn)

植物乳桿菌進(jìn)入人體后，胃部的高酸性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致植物乳桿菌死亡，植物乳桿菌要想在人體中發(fā)揮益生作用，就必須要能夠抵抗胃部的惡劣環(huán)境，順利進(jìn)入腸道內(nèi)。由于食物的成分和食入量的不同，人體胃液通常會(huì)發(fā)生波動(dòng)。試驗(yàn)選擇pH值為1.5的人工胃液來模擬胃部環(huán)境，以考察植物乳桿菌緩釋微膠囊對植物乳桿菌的保護(hù)效果。人體胃部消化食物的過程為2~3 h，所制備的微膠囊應(yīng)該在這段時(shí)間內(nèi)有效保護(hù)植物乳桿菌抵御胃部惡劣環(huán)境的傷害，使其順利通過胃部，進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用。因此，試驗(yàn)選擇將微膠囊放于人工胃液中處理3 h。

微膠囊在人工胃液中的耐受性見圖1。

圖1 微膠囊在人工胃液中的耐受性

由圖1可知，隨著時(shí)間的延長，各樣品的菌體存活率均有所下降，經(jīng)人工胃液處理3 h后，未微膠囊化的植物乳桿菌菌體數(shù)量快速下降，活菌數(shù)明顯減少。而包埋后的新鮮微膠囊和凍干微膠囊在人工胃液處理后，植物乳桿菌的存活率仍保持較高的水平，均達(dá)到75%，活菌數(shù)分別可達(dá)到1.75×109CFU/g和1.52×109CFU/g。這說明，微膠囊化能夠幫助植物乳桿菌抵抗胃酸的傷害，微膠囊化的壁材對菌株起到了良好的保護(hù)作用，這與Chandramouli V等人的研究結(jié)果相似。分析其原因，可能是由于微膠囊中海藻酸鈉在低pH值下比較穩(wěn)定，能夠很好地保護(hù)菌體免受胃酸的傷害。結(jié)果說明，制備的微膠囊能夠順利進(jìn)入腸道內(nèi)。

2.2 腸液耐受性試驗(yàn)

微膠囊在人工腸液中的耐受性見圖2。

圖2 微膠囊在人工腸液中的耐受性

由圖2可知，隨時(shí)間的延長，經(jīng)人工腸液處理后的微膠囊中活菌數(shù)逐漸下降，3 h后微膠囊中活菌數(shù)仍能達(dá)到70%。結(jié)果說明，制備的植物乳桿菌緩釋微膠囊能夠抵抗人工腸液的破壞。

2.3 貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

植物乳酸菌經(jīng)微膠囊化后，受到壁材的保護(hù)，能夠有效避免外界溫度對菌體的傷害。因此，選擇合適的貯藏溫度對于提高菌體存活率、提高貯藏穩(wěn)定性至關(guān)重要。

不同貯藏溫度對微膠囊化植物乳桿菌存活率的影響見圖3。

圖3 不同貯藏溫度對微膠囊化植物乳桿菌存活率的影響

由圖3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，微膠囊中植物乳桿菌的存活率逐漸下降；隨著貯藏溫度的降低，活菌數(shù)逐漸升高。其中，在-20℃條件下貯藏微膠囊活菌數(shù)最高，貯藏6個(gè)月活菌數(shù)仍達(dá)5.8× 108CFU/g；而在25℃條件下貯藏的微膠囊隨著貯藏時(shí)間的延長，活菌數(shù)大大下降，可見在25℃條件下不利于貯藏微膠囊。因此，-20℃條件下貯藏微膠囊效果較佳。

2.4 37℃貯藏性試驗(yàn)

37℃對微膠囊化植物乳桿菌存活率的影響見圖4。

圖4 37℃對微膠囊化植物乳桿菌存活率的影響

由圖4可知，37℃條件下貯藏的菌粉在30 d后僅能夠檢測出少量活菌，而經(jīng)包埋后的植物乳桿菌在60 d時(shí)活菌數(shù)仍能達(dá)到1.9×108CFU/g，說明微膠囊化的壁材對植物乳桿菌起到了很好的保護(hù)作用，較好地隔絕了外部熱量。

2.5 降膽固醇性能測定

2.5.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖5可知，采用國標(biāo)法繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定體系的曲線擬合后相關(guān)性很好（R2=0.975 5），可用于待測菌株的膽固醇降解能力評價(jià)。

2.5.2 膽固醇降解率的測定

植物乳桿菌菌粉和微膠囊的降膽固醇性能見表1。

表1 植物乳桿菌菌粉和微膠囊的降膽固醇性能

由表1可知，經(jīng)包埋后的植物乳桿菌對膽固醇的降解率要低于未被包埋植物乳桿菌對膽固醇的降解率，但仍表現(xiàn)出較好的降解效果，說明微膠囊化并沒有影響植物乳桿菌發(fā)揮其對膽固醇的降解能力，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

對實(shí)驗(yàn)室自行制備的植物乳桿菌緩釋微膠囊進(jìn)行人工胃液和腸液的處理，并研究了微膠囊的貯藏穩(wěn)定性及降膽固醇性能。結(jié)論如下：①經(jīng)人工胃液處理3 h，包埋后的新鮮微膠囊和凍干微膠囊在人工胃液處理后，植物乳桿菌的存活率仍保持較高的水平，均可達(dá)到75%，說明所制備的植物乳桿菌緩釋微膠囊對人工胃液有很好的耐受性。②將經(jīng)過人工胃液處理后的植物乳桿菌微膠囊放入人工腸液中處理3 h后，測得微膠囊中活菌數(shù)仍有70%，證實(shí)植物乳桿菌緩釋微膠囊對人工腸液有很好的耐受性。③放于-20℃貯藏的微膠囊活菌數(shù)量在6個(gè)月后仍可達(dá)5.8×108CFU/g。經(jīng)包埋后的植物乳桿菌在37℃條件下貯藏，2個(gè)月時(shí)活菌數(shù)仍能達(dá)到1.9×108CFU/g，說明微膠囊化的壁材對植物乳桿菌起到了很好的保護(hù)作用。④未包埋植物乳桿菌的膽固醇降解率為28.46%，而包埋后植物乳桿菌的膽固醇降解率為25.73%。雖然包埋后的植物乳桿菌對膽固醇的降解率要低于未包埋植物乳桿菌對膽固醇的降解率，但仍表現(xiàn)出較好的降解效果，說明微膠囊化并沒有顯著影響植物乳桿菌發(fā)揮其對膽固醇的降解能力。

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Stability Analysis of a Plant Lactobacillus Microcapsule in Vitro

WANG Changyuan1，F(xiàn)ENG Yuchao1，CHEN Guanghui2，YU Changqing1，XU Min1，YAO Di1，LI Zhijiang1，QIAN Lili1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China；2.Heilongjiang Reclamation Yingbohuawei Dairy Industry Co.，Ltd.，Yichun，Heilongjiang 153000，China）

To measure the control-released microcapsules stability in vitro of plant Lactobacillus which are made by themselves. Analyzes its tolerability by simulating the gastric and intestinal environment and then compared the storage stability and cholesterol lowering properties under different temperature.The viable count of plant Lactobacillus in freeze-drying microcapsules can reach to 75%and 70%after treated by artificial gastric juice and intestinal juice for 3 h respectively.Microcapsules put in-20℃had the most viable count and still reach 5.8×108CFU/g after 6 months.Cholesterol removal efficiency of post embedding plant Lactobacillus can reach to 25.73%.The micro-encapsulated wall material has a good protective effect on plant Lactobacillus，and its stability is good in vitro.

plant Lactobacillus；control-released microcapsule；stability measure；cholesterol

TS202.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.041

1671-9646（2017）02b-0048-04

2016-12-20

黑龍江省高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化前期研發(fā)培育項(xiàng)目（1254CGZH33）。

王長遠(yuǎn)（1976— ），男，博士，教授，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白。