李 琳，程 潔，樓之茵，趙忠新

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)· ·論著·

大麻素1型受體拮抗劑對激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能研究

李 琳，程 潔，樓之茵，趙忠新

目的 觀察大麻素1型受體拮抗劑SR141716A(SR1)對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。方法 使用致炎因子干擾素-γ(IFN-γ)刺激激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，建立模擬EAE炎性環(huán)境的細(xì)胞模型，比較靜息態(tài)BV2細(xì)胞組、激活態(tài)BV2細(xì)胞組和SR1干預(yù)組CB1R mRNA和蛋白的表達(dá)情況，用ELISA方法檢測細(xì)胞因子和趨化因子的濃度，Griess試劑法檢測一氧化氮(NO)濃度，MTT法檢測細(xì)胞增殖率。結(jié)果 激活態(tài)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞CB1R mRNA和蛋白的表達(dá)均高于靜息態(tài)BV2細(xì)胞組(P<0.05)；大麻素1型受體拮抗劑SR1可降低激活態(tài)的BV2細(xì)胞CB1R mRNA 和蛋白的表達(dá)(P<0.05)；SR1可顯著上調(diào)IFN-γ、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，增加BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞NO 的釋放(P<0.05)，而顯著下調(diào)IL-4、IL-17 和MCP-1 的濃度，對IL-10、IL-1β和CX3CL1 無調(diào)節(jié)作用。SR1 對IFN-γ活化的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞增殖無影響 (P>0.05)。結(jié)論 CB1R參與了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，CB1R在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡和NO分泌中發(fā)揮了一定的作用。

大麻素1型受體小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子趨化因子

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種自身免疫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，是年輕人最常見的非外傷性致殘性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前沒有很好的根治方法。許多證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞可啟動或促進(jìn)MS的神經(jīng)炎癥，脫髓鞘和神經(jīng)變性，但也有證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)保護(hù)進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[1]。最近研究提示：小膠質(zhì)細(xì)胞可能存在表型和功能不同的亞型，即神經(jīng)毒性的“M1”型和神經(jīng)保護(hù)的“M2”型亞群[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞僅在過度激活、特定刺激或是功能受損的情況下發(fā)揮有害的效應(yīng)[3]。處于過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量促炎因子，對神經(jīng)細(xì)胞造成炎性損傷。如何人為調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，趨利避害，是改善EAE臨床癥狀的可能干預(yù)機(jī)制之一。

近來的研究證實MS中存在內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system, ECS)功能失調(diào)[4]。目前印度大麻作為緩解癥狀的藥物被用于15%的MS患者，許多研究表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)具有神經(jīng)保護(hù)作用[5]。動物實驗中發(fā)現(xiàn)使用大麻素1型受體(cannabinoid 1 receptor，CB1R)激動劑對EAE動物模型有神經(jīng)保護(hù)作用[6]；CB1R缺乏的EAE小鼠臨床癥狀更嚴(yán)重，提高內(nèi)源性大麻素安南得邁的水平可以減輕EAE神經(jīng)功能缺損[7]； 1位46歲女性在參加CB1R拮抗劑(SR-141716A)治療肥胖癥的臨床試驗半年時出現(xiàn)MS的表現(xiàn)，停藥后數(shù)周其癥狀基本消失[8]。這些證據(jù)都提示CB1R參與了MS的發(fā)生發(fā)展，可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但迄今有關(guān)CB1R對小膠質(zhì)細(xì)胞表型和功能的調(diào)控及其在MS免疫調(diào)控中的機(jī)制卻知之甚少。為進(jìn)一步了解CB1R變化對小膠質(zhì)細(xì)胞表型和功能的調(diào)控作用，本研究利用干擾素-γ(IFN-γ)刺激激活小鼠源性BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，建立模擬EAE炎性環(huán)境的細(xì)胞模型，觀察CB1R拮抗劑SR141716A(SR1)對小膠質(zhì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 小鼠BV2細(xì)胞系購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco公司)、IFN-γ(Abcam公司)、Prime Script TM RT Reagent試劑盒和Real-time PCR Reagent試劑盒(TAKARA 公司)、兔抗小鼠CB1 多克隆抗體(Cayman Chemicals公司)、兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體(Epitomics公司)、一氧化氮(NO)檢測試劑盒(上海碧云天公司)以及細(xì)胞因子和趨化因子ELISA試劑盒：IL-1βELISA試劑盒(Invitrogen)，IL-4 、IL-10、IL-17 ELISA試劑盒(eBioscienceInc)、IL-6 ELISA試劑盒(Peprotech)、TNF-α、IFN-γ、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)ELISA試劑盒(Pepro tech Inc)和人趨化因子(CX3CL1)ELISA試劑盒(R&D Systems)。

1.2 BV2細(xì)胞傳代培養(yǎng)以及實驗分組 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2和95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到95%融合時進(jìn)行細(xì)胞傳代。調(diào)整細(xì)胞密度為3.5×105/ml，接種于相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板中，取培養(yǎng)2～3 d，生長狀態(tài)良好的BV2細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗分為3組：靜息態(tài)BV2細(xì)胞組：BV2+溶劑對照(PBS:DMSO=1∶1)；激活態(tài)BV2細(xì)胞組：BV2+IFN-γ(100 kU/L)+溶劑對照；SR1干預(yù)組：BV2+IFN-γ(100 kU/L)+SR1(1 μmol/L)，處理24 h。

1.3 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR法 采用TRIZOL試劑分別提取各組細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)擴(kuò)增組織樣本cDNA。參照gene bank的小鼠CB1R cDNA序列設(shè)計引物。CB1R引物：上游序列5’-CTG GAA CTG CAA GAA GCT-3’，下游序列5’-GCC CCA GCA GAT GAT CAA CAC C-3’，理論擴(kuò)增長度為310 bp；反應(yīng)條件為95 ℃ 90 s，58 ℃ 90 s，72 ℃ 120 s，循環(huán)40次。以參照基因β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對定量，分析各組CB1R基因表達(dá)的相對比率。

1.4 Western-blot實驗 收集培養(yǎng)液中細(xì)胞及貼壁細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS吹打洗滌并離心2次，加入100 μl裂解液在冰上裂解30 min，4 ℃離心(12 000×g, 5 min)，取上清液。二辛可寧酸(bicinchonininc acid，BCA)法進(jìn)行蛋白定量。用12% SDS-Page不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，分別加入兔抗CB1R(1∶300)和兔抗GAPDH (1∶1 000)，4 ℃孵育過夜漂洗，加相應(yīng)熒光偶聯(lián)的抗兔二抗(1∶1 200)，室溫孵育1 h，洗膜后，使用Odyssey掃描儀檢測熒光強(qiáng)度，獲取相應(yīng)Western-blot譜帶的光密度值，CB1R表達(dá)量以CB1R與內(nèi)參GAPDH整合光密度比值表示。

1.5 用ELISA方法檢測細(xì)胞因子和趨化因子的濃度 使用ELISA試劑盒對干預(yù)后細(xì)胞上清液IL-1β，IL-4、IL-10、IL-17、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量進(jìn)行測定。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，使得稀釋后各孔加樣量均為50 μl，濃度分別為240、160、80、40、20 ng/L。分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部(5倍稀釋)，輕晃混勻。經(jīng)溫育、配液、洗滌、加酶、顯色等操作，最終加入終止液終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，測定450 nm波長各孔吸光度值。

1.6 NO測定(Griess法) 收集各組細(xì)胞上清液，以50 μl/孔依次加入96 孔板，參照試劑盒說明書先后加入Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ液，室溫下避光放置5 min；540 nm波長處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查取對應(yīng)的NO濃度。

1.7 四唑鹽(MTT)檢測 將BV2細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別給予相應(yīng)刺激24 h，每份樣本均進(jìn)行6復(fù)孔檢測；在各孔中加入MTT溶液(終濃度為0.5 g/L)，置37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，輕微震蕩使顆粒溶解，置酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度(OD值)。細(xì)胞增殖率(%)=(檢測組OD值/對照組OD值)×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示；計量資料先進(jìn)行兩樣本方差齊性檢驗，樣本符合正態(tài)分布且方差齊時，兩組間比較采用t檢驗，方差不齊時，采用校正t’檢驗：P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BV2細(xì)胞CB1R mRNA和蛋白表達(dá)的變化 IFN-γ激活的BV2細(xì)胞CB1R mRNA 和蛋白的水平均高于靜息態(tài)BV2細(xì)胞組(P<0.05)，使用SR1 干預(yù)后，可降低激活態(tài)BV2細(xì)胞CB1R mRNA 和蛋白的表達(dá)，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2 SR1對激活態(tài)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子與趨化因子的影響 與對照組比較，經(jīng)IFN-γ(100 kU/L)處理后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17和趨化因子MCP-1 和CX3CL1 的濃度均顯著增高(P<0.05)；而IL-4 的濃度顯著降低(P<0.05)。使用CB1R抑制劑SR1(1 μmol/L)干預(yù)后，IFN-γ、IL-6 和TNF-α的濃度較溶劑對照組顯著升高(P<0.05)；IL-17、IL-4和MCP-1 的水平較對照組顯著降低(P<0.05)；IL-10、IL-1β和CX3CL1的濃度無顯著變化(P>0.05)。上述結(jié)果顯示SR1 可顯著上調(diào)IFN-γ、IL-6 和TNF-α的水平，顯著下調(diào)IL-17、IL-4和MCP-1 的濃度，對IL-10、IL-1β和CX3CL1無調(diào)節(jié)作用。見圖2。

注：IFN-γ：干擾素-γ，SR1：大麻素I型受體拮抗劑，TNF-α：腫瘤壞死因子-α，IL：白細(xì)胞介素，MCP-1：單核細(xì)胞趨化因子-1，CX3CL1：人趨化因子。0組：靜息態(tài)BV2細(xì)胞組；IFN-γ組：激活態(tài)BV2細(xì)胞組；IFN-γ+SR1組：SR1干預(yù)組。與IFN-γ組比較aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001圖2 不同干預(yù)對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子和趨化因子的影響

2.3 不同組別BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放 通過對各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的觀察，發(fā)現(xiàn)激活態(tài)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放顯著增加，CB1R抑制劑SR1進(jìn)一步增加激活態(tài)BV2細(xì)胞NO的釋放(P<0.05)(圖3)。

注：IFN-γ：干擾素-γ，SR1：大麻素I型受體拮抗劑。0組：靜息態(tài)BV2細(xì)胞組；IFN-γ組：激活態(tài)BV2細(xì)胞組；IFN-γ+SR1組：SR1干預(yù)組。與IFN-γ組比較aP<0.01圖3 靜息態(tài)與激活態(tài)不同組別BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放

2.4 不同組別BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖率的比較 通過MTT 實驗比較不同組別BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖率，結(jié)果提示IFN-γ可促進(jìn)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，SR1 對IFN-γ活化的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖無影響 (P>0.05)(圖4)。

注：IFN-γ：干擾素-γ，SR1：大麻素I型受體拮抗劑。0組：靜息態(tài)BV2細(xì)胞組；IFN-γ組：激活態(tài)BV2細(xì)胞組；IFN-γ+SR1組：SR1干預(yù)組。與IFN-γ組比較aP<0.05圖4 各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖率

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)是一把雙刃劍，中毒、缺血、出血、感染、變性等病理狀態(tài)均可通過免疫細(xì)胞產(chǎn)生有害或有益的連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或修復(fù)[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS內(nèi)最主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，在神經(jīng)免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在MS中的作用目前還不十分清楚。過去認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞在MS中分泌炎性因子，釋放炎性介質(zhì)，引起脫髓鞘、軸突變性等神經(jīng)毒性作用，但近來許多研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞具有分泌神經(jīng)保護(hù)性因子、清除髓磷脂碎片、招募干細(xì)胞和誘導(dǎo)神經(jīng)形成等作用[10]。因此，發(fā)揮小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用，使其在MS中充當(dāng)“保護(hù)與修復(fù)者”角色，是改善MS臨床癥狀的可能干預(yù)機(jī)制之一。

近年來，有關(guān)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system, ECS)在MS中的作用正逐漸得到廣泛關(guān)注并成為新的研究熱點。研究證實：MS中存在ECS功能失調(diào)[2]，植物源性大麻素治療MS的多個大型臨床雙盲實驗的結(jié)論不一致[11]。由于內(nèi)源性大麻素按需合成，快速降解的特點，所以，CBR在MS發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用成為新的研究熱點和難點。目前有關(guān)CB1R介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的研究不多。Lourbopoulos等[12]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性大麻素(2-AG)治療的EAE小鼠腦組織中CB1R的表達(dá)顯著增多，腦室旁M2型巨噬細(xì)胞顯著增多(2～4倍)，淋巴細(xì)胞增殖率顯著下降，提示活化CB1R，可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞由神經(jīng)毒性向神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)轉(zhuǎn)變。

本實驗使用的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞是小鼠來源的永生化小膠質(zhì)細(xì)胞，具有與原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞相近的生理病理功能，給予IFN-γ刺激后可以被活化，建立模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性環(huán)境的細(xì)胞模型，被廣泛應(yīng)用于小膠質(zhì)細(xì)胞的功能研究。本研究結(jié)果顯示IFN-γ刺激可誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞CB1R的表達(dá)顯著增高，進(jìn)一步證實了小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的CB1R參與了炎癥反應(yīng)。

有學(xué)者認(rèn)為大麻素可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13-14]。筆者進(jìn)一步檢測了特異性CB1R抑制劑(SR141716A，SR1)干預(yù)的激活態(tài)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的濃度變化。結(jié)果顯示，IFN-γ刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，其分泌致炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α和趨化因子MCP-1和CX3CL1的濃度均顯著增高，給予CB1R拮抗劑后，培養(yǎng)上清液中致炎性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6和TNF-α的濃度較相同時點的溶劑對照組顯著升高，IL-17、IL-4和MCP-1的水平顯著降低，而對IL-10、IL-1β和CX3CL1的水平無顯著影響?？梢奀B1R在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡中發(fā)揮了一定的作用。筆者推測抑制CB1R可使小膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)毒性的M1亞型轉(zhuǎn)化。

在MS炎癥病灶中，NO的濃度明顯增高。小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過增加NO釋放，抑制DNA合成和干擾能量代謝直接損傷髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用；同時可以增加血腦屏障的通透性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附和透過血管壁進(jìn)入腦實質(zhì)。BV2小膠質(zhì)細(xì)胞被IFN-γ激活后NO釋放顯著增加，使用CB1R拮抗劑SR1后，NO釋放進(jìn)一步增加，CB1R的免疫調(diào)節(jié)作用可能與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞NO分泌有關(guān)。

在MS/EAE中樞病灶內(nèi)，有大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞活化和聚集是中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵的致病因素[1]。本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，但抑制CB1R對IFN-γ活化的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖無影響，提示CB1R的免疫調(diào)節(jié)作用可能并不通過抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖途徑而發(fā)揮。

綜上所述，CB1R在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡和NO分泌中發(fā)揮了一定的作用，由于ECS對機(jī)體的影響廣泛而復(fù)雜，本實驗針對CB1R的免疫調(diào)節(jié)作用做了初步探討，并試圖通過相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的檢測發(fā)現(xiàn)可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

[1] Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Macrophage subsets and microglia in multiple sclerosis[J]. Acta Neuropathol, 2014, 128(2): 191-213. DOI:10.1007/s00401-014-1310-2.

[2] Mecha M, Feliú A, Carrillo-Salinas FJ, et al. Endocannabinoids drive the acquisition of an alternative phenotype in microglia[J]. Brain Behav Immun, 2015, 49: 233-245. DOI:10.1016/j.bbi.2015.06.002.

[3] Gao Z, Tsirka SE. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis[J]. Neurol Res Int, 2011, 2011: 383087. DOI:10.1155/2011/383087.

[4] Rossi S, Bernardi G, Centonze D. The endocannabinoid system in the inflammatory and neurodegenerative processes of multiple sclerosis and of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Exp Neurol, 2010, 224(1): 92-102. DOI:10.1016/j.expneurol.2010.03.030.

[5] Van der Walt A, Butzkueven H, Kolbe S, et al. Neuroprotection in multiple sclerosis: a therapeutic challenge for the next decade[J]. Pharmacol Ther, 2010, 126(1): 82-93. DOI:10.1016/j.pharmthera.2010.01.006.

[6] Rossi S, Furlan R, De Chiara V, et al. Cannabinoid CB1 receptors regulate neuronal TNF-α effects in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(6): 1242-1248. DOI:10.1016/j.bbi.2011.03.017.

[7] Lou ZY, Zhao CB, Xiao BG. Immunoregulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by the selective CB1 receptor antagonist[J]. J Neurosci Res, 2012, 90(1): 84-95. DOI:10.1002/jnr.22721.

[8] van Oosten BW, Killestein J, Mathus-Vliegen EM, et al. Multiple sclerosis following treatment with a cannabinoid receptor-1 antagonist[J]. Mult Scler, 2004, 10(3): 330-331. DOI:10.1191/1352458504ms1044oa.

[9] Kerschensteiner M, Meinl E, Hohlfeld R. Neuro-immune crosstalk in CNS diseases[J]. Results Probl Cell Differ, 2010, 51: 197-216. DOI:10.1007/400_2009_6.

[10] Napoli I, Neumann H. Protective effects of microglia in multiple sclerosis[J]. Exp Neurol, 2010, 225(1): 24-28. DOI:10.1016/j.expneurol.2009.04.024.

[11] Serpell MG, Notcutt W, Collin C. Sativex long-term use: an open-label trial in patients with spasticity due to multiple sclerosis[J]. J Neurol, 2013, 260(1): 285-295. DOI:10.1007/s00415-012-6634-z.

[12] Lourbopoulos A, Grigoriadis N, Lagoudaki R, et al. Administration of 2-arachidonoylglycerol ameliorates both acute and chronic experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Brain Res, 2011, 1390: 126-141. DOI:10.1016/j.brainres.2011.03.020.

[13] Correa F, Hernangómez-Herrero M, Mestre L, et al. The endocannabinoid anandamide downregulates IL-23 and IL-12 subunits in a viral model of multiple sclerosis: evidence for a cross-talk between IL-12p70/IL-23 axis and IL-10 in microglial cells[J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(4): 736-749. DOI:10.1016/j.bbi.2011.01.020.

[14] Correa F, Hernangómez M, Mestre L, et al. Anandamide enhances IL-10 production in activated microglia by targeting CB(2) receptors: roles of ERK1/2, JNK, and NF-kappaB[J]. Glia, 2010, 58(2): 135-147. DOI:10.1002/glia.20907.

(本文編輯：林永麗)

Immunomodulation of activated BV2 microglia by cannabinoid 1 receptor antagonist

LiLin,ChengJie,LouZhiyin,ZhaoZhongxin

(DepartmentofNeurology,XinhuaHospital,SchoolofMedicineAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200092,China)

Objective To observe the immunomodulation of activated BV2 microglia by cannabinoid 1 receptor (CBIR) antagonist.Methods IFN-γwas used to stimulate BV2 microglia, and the cell model for the simulation of EAE inflammatory environment was developed. The expression levels of the CB1R mRNA and the protein in the rest BV2 group, the activated BV2 group and the SR1 intervention group were detected respectively. The concentrations of cytokines and chemokines were monitored by ELISA method, the concentration of nitric oxide was detected by Griess reagent, and proliferation rate of cells was detected by MTT.Results The expression levels of CB1RmRNA and protein of the activated BV2 were significantly higher than those of the rest BV2 group (P<0.05). Cannabinoid 1 receptor antagonist SR1 could decrease the expression levels of CB1RmRNA and protein of the activated BV2 (P<0.05). SR1 could significantly up-regulate the expression levels of IFN-γ, IL-6 and TNF-α, increase the releasing level of NO of BV2 (P<0.05) and significantly down-regulate the expression levels of IL-4, IL-17 and MCP-1. However, it had no effect on the regulation of IL-10, IL-1βand CX3CL1, and also it had no effect on the proliferation of the IFN-γ-activated BV2 (P>0.05).Conclusion CB1R was involved in the immunoregulation mediated by microglia, CB1R played a certain role in the regulation of cytokine network balance and NO secretion.

Cannabinoid 1 receptor; Microglia; Cytokines; Chemokine

國家自然科學(xué)青年基金(81200921)

200092 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院(李琳、程潔、樓之茵)；第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(趙忠新)

趙忠新，電子信箱：zhaozx@medmail.com.cn

R392.11

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.02.011

2015-12-22)