劉俊華 王 勇 王顏顏 王曉民*

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經(jīng)生物學系，北京 100069；2.教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100069；3.北京腦重大疾病研究院，北京 100069；4.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京 100069)

·基礎研究 ·

深部腦磁刺激對帕金森病模型大鼠運動癥狀治療的安全性評價

劉俊華1,2,3王 勇2,3,4王顏顏1,2,3王曉民1,2,3*

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經(jīng)生物學系，北京 100069；2.教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100069；3.北京腦重大疾病研究院，北京 100069；4.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京 100069)

目的 評估深部腦磁刺激(deep-brain magnetic stimulation，DMS)對單側(cè)帕金森病(Parkinson’s disease，PD)模型大鼠運動障礙的治療作用及DMS治療的安全性。方法 立體定位注射六羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)于大鼠右側(cè)紋狀體制備單側(cè)帕金森病模型，假手術(shù)對照組(Sham組)依據(jù)同樣方法注射0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液。利用阿撲嗎啡篩選模型后，造模成功的動物采用均衡隨機化分組的方式分為模型對照組(Model組)、δ節(jié)律DMS治療組(DMS-δ組)、γ節(jié)律DMS治療組(DMS-γ組)，其中兩種DMS治療組行每天40 min、持續(xù)4周的DMS治療。通過碰壁實驗檢測大鼠運動行為，通過大鼠體質(zhì)量的測定、外周血淋巴細胞的分類及計數(shù)、主要組織器官的蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色評價DMS治療的安全性。結(jié)果 ①檢測大鼠運動行為顯示，DMS-γ治療組損傷側(cè)的肢體利用率顯著高于Model組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而DMS-δ組相較于Model組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。②Sham組、Model組、DMS-δ組、DMS-γ組大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。③Sham組、Model組、DMS-δ組、DMS-γ組大鼠外周血總淋巴細胞與T細胞的數(shù)量和比例差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。DMS-δ組大鼠的自然殺傷(natural killer，NK)細胞數(shù)量和比例相較于Model組有顯著改善。④HE染色顯示，DMS對大鼠主要器官包括心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸均未造成明顯的組織病理變化。結(jié)論 DMS-γ治療可改善PD大鼠雙側(cè)肢體不對稱性運動障礙，且DMS對PD大鼠運動行為的治療中無明顯不良反應，表明DMS在對PD大鼠運動癥狀的治療中具有很好的安全性。

帕金森?。簧畈磕X磁刺激；運動行為學；不良反應；安全性

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是多發(fā)生于中老年期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD的主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元變性丟失，造成紋狀體多巴胺的量下降，引起包括靜止性震顫、肌肉僵直、步態(tài)不穩(wěn)與運動遲緩等一系列運動癥狀；同時伴隨路易體的傳播和聚集，引起廣泛腦區(qū)病變[1-2]。目前PD的治療手段主要包括藥物治療和手術(shù)治療。左旋多巴(levo-dopamine, L-DOPA)類藥物是治療PD的標準用藥，但長期使用L-DOPA帶來嚴重的不良反應[3]。深部腦刺激(deep brain stimulation, DBS)作為中晚期PD的有效治療手段，但仍會伴隨運動障礙的產(chǎn)生且需要患者承擔昂貴的醫(yī)療費用和手術(shù)風險，且有效期只能維持數(shù)年[4-5]。所以發(fā)展新的治療手段顯得十分必要。

近年來，作為一種非藥物、非侵入性的治療手段，重復經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)已經(jīng)應用于阿爾茲海默病、抑郁癥等神經(jīng)精神類疾病的治療[6-7]。但傳統(tǒng)rTMS的局限性在于，其主要作用于皮質(zhì)，而很多神經(jīng)精神類疾病的病灶位于深部腦區(qū)，這就制約了rTMS應用范圍的拓展[8]；rTMS設備昂貴，一般只能在專業(yè)醫(yī)療機構(gòu)才能使用，這也進一步限制了rTMS的普及；另外rTMS的有效刺激頻率一般為0.5～10 Hz，且一般不會超過30 Hz，強度都在特斯拉(T)級別，有研究[9-10]報告顯示rTMS具有誘發(fā)頭痛、癲癇發(fā)作和不自主運動等的不良反應。由此看來，發(fā)展能作用于深腦、小型化且低強度的磁刺激術(shù)是更為理想的趨勢。深部腦磁刺激(deep-brain magnetic stimulation, DMS)是一種新型的經(jīng)顱磁刺激治療腦功能障礙的技術(shù)，平行雙線圈中間提供強度均等的磁場，可經(jīng)顱無損地作用于深部腦區(qū)[8]。其采用高斯(Gs)級別(10 000 Gs= 1 T)的低強度、高頻(1 000 Hz)刺激；并通過對低強度高頻單波的串列組合，輸出不同節(jié)律的有效刺激串。在神經(jīng)精神類疾病的治療方面，目前已有報道DMS可促進成年小鼠海馬神經(jīng)元再生和成熟，改善抑郁癥狀和與應激相關的反應[11]。所以對于病灶位于深部腦區(qū)的PD病人來說，DMS能否發(fā)揮療效及其治療的安全性十分值得研究。

本研究中的DMS治療儀通過高頻低強度單波組合輸出的方式，可提供可變節(jié)律的刺激參數(shù)，這里筆者用到δ節(jié)律和γ節(jié)律兩種不同刺激方式，以期研究DMS對PD病人運動癥狀的療效特別是DMS治療的安全性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備

健康SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200g，購自北京維通利華實驗大鼠中心[實驗動物許可證號：SYXK(京)2014-0018]。首都醫(yī)科大學實驗動物部飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜亮暗循環(huán)，自由進水進食。對實驗動物的所有實驗方案通過首都醫(yī)科大學倫理審查委員會批準。本實驗應用立體定位注射六羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)于大鼠右側(cè)紋狀體制備單側(cè)帕金森病動物模型[12]。術(shù)前適應1周并剔除異常旋轉(zhuǎn)大鼠。腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)深度麻醉，頭部去毛，碘伏消毒，固定于立體定位儀(美國Kopf公司)。切開大鼠顱頂正中線皮膚，剝離骨膜暴露前后囟，調(diào)平。依Paxinos & Watson 圖譜確定右紋狀體兩個注射位點，即前囟前0.8 mm、旁開2.7 mm、硬腦膜下5.2 mm/4.5 mm。按坐標位點鉆開顱骨，緩慢下行微量進樣針(上海高鴿，10 μL)以0.5 μL/min的速度向每個位點注射10 μg 6-OHDA(5 μg/μL, 美國Sigma公司, H116)，每點停針5 min后緩慢退針，縫合頭皮，碘伏消毒，放于電熱毯上，待動物蘇醒后安置于原籠位。Sham組運用相同方法注射0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液。

1.2 動物分組及處理

手術(shù)10 d后，以阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實驗進行模型篩選[13]。首先將大鼠固定在束縛套中，平靜適應5 min，按0.25 mg/kg劑量皮下注射阿撲嗎啡(美國Sigma公司, D043)。給藥5 min后，用旋轉(zhuǎn)行為記錄儀(美國Columbus Instruments公司)統(tǒng)一測定30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)情況，過程中保持測定環(huán)境的安靜與避光。以向左側(cè)(損傷側(cè)肢體)轉(zhuǎn)數(shù)減向右側(cè)(健康側(cè)肢體)轉(zhuǎn)數(shù)為凈轉(zhuǎn)數(shù)。以轉(zhuǎn)數(shù)超過60者為成功模型。將成功模型采用均衡隨機化分組的方式分為Model組、DMS-δ組、DMS-γ組，另納入Sham組。其中，在DMS-δ組和DMS-γ組中，大鼠放于深部腦磁刺激治療儀(天津安提斯)的刺激盒中分別給予每天40 min持續(xù)4周的DMS治療(圖1)。對于DMS這種磁刺激來說，單波刺激頻率達到1 000 Hz，遠遠超出神經(jīng)元的反應極限，但把單波組合成串后，每一串可視作一個有效刺激。在DMS-δ組中，動物給予了一種1串/s的磁刺激輸出，有效刺激為1 Hz，是一種δ節(jié)律的磁刺激輸出，而在DMS-γ組中，動物給予了一種30～40串/s的磁刺激輸出，有效刺激為30～40 Hz，磁刺激輸出在γ范圍。Sham組與Model組同樣放于刺激盒但不給予治療。在治療的第0、1、2、3、4周進行體質(zhì)量測定及行為學檢測。

圖1 深部腦磁刺激治療參數(shù)

Among each DMS treatment group, 40 minutes trains of DMS were administered daily for 4 weeks. (A)δ rhythm DMS treatment (DMS-δ). (B) γ rhythm DMS treatment (DMS-γ). DMS: deep-brain magnetic stimulation.

1.3 碰壁實驗(Cylinder Test)

此實驗用來檢測大鼠前肢的不對稱利用率，契合6-OHDA單側(cè)損毀模型的行為學特點[14]，可用于評價DMS的治療效果。在治療的第0、1、2、3、4周將大鼠置于直徑20 cm，高30 cm的透明有機玻璃圓筒內(nèi)。用攝像機記錄大鼠在圓筒內(nèi)進行探索性運動的情況，歷時5 min。采用盲法計數(shù)雙側(cè)前肢觸碰圓筒壁的次數(shù)。損傷側(cè)(即為受損腦半球的對側(cè))前肢觸壁次數(shù)用impaired表示，未損傷側(cè)(即為受損腦半球的同側(cè))前肢觸壁次數(shù)用unimpaired表示，雙側(cè)同時觸壁用both表示。損傷側(cè)前肢利用率的計算方式為：

1.4 體質(zhì)量測定

動物體質(zhì)量的變化在一定程度上能反映一段時間內(nèi)動物的體質(zhì)變化情況[15]，進而反映DMS治療是否對動物的體質(zhì)產(chǎn)生影響。分別于治療的第0、1、2、3、4周用電子秤在同一時間對4組大鼠的體質(zhì)量進行稱量。

1.5 外周血淋巴細胞的分類及計數(shù)

此實驗用來反映動物長時間暴露于磁場是否會引起免疫系統(tǒng)的損傷。在磁刺激治療4周后于大鼠尾靜脈取適量新鮮外周血置于10 g/L EDTA真空采血管內(nèi)備用。首先檢查絕對計數(shù)管內(nèi)計數(shù)微球顆粒是否完好且位于計數(shù)管金屬網(wǎng)下面，標明試劑和樣本編號。用移液器采用反式加樣法吸取20 μL各個合適抗體試劑加到金屬網(wǎng)上方，勿接觸到微球顆粒，多種抗體可混合加入。充分混勻抗凝全血，吸取50 μL加到金屬網(wǎng)上方管壁上。蓋上管蓋，輕輕渦旋混合，室溫避光孵育15 min。向計數(shù)管內(nèi)加入450 μL的1×溶血素，蓋上管蓋，輕輕渦旋混合，室溫避光孵育15 min。于流式細胞分析儀分析測定。使用BD Cell QuestTM軟件獲取細胞，調(diào)整流式細胞儀通道電壓及各熒光顏色補償，以分離目的細胞群。流式細胞測定所用抗體及試劑耗材見表1。

表1 流式細胞術(shù)所需試劑耗材

1.6 HE染色

DMS治療4周后，各組動物按40 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，待動物深度麻醉后固定在解剖盤內(nèi)，打開胸腔暴露心臟。輸液器針頭刺入左心室進入主動脈，快速灌注37 ℃的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液150 mL，隨后灌注4 ℃預冷的4%(質(zhì)量分數(shù))的多聚甲醛200 mL。待頭、尾、四肢僵硬后，停止灌流，取出心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸，置于4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛中后固定24 h，依次采用20%和30%(質(zhì)量分數(shù))蔗糖梯度脫水至下沉。取出組織塊，OCT包埋，用Leica冰凍切片機于-20 ℃切片，厚度為10 μm，貼于載玻片，可-80 ℃保存待用。先用蒸餾水浸泡切片2 min，用蘇木素染液染色5 min，自來水沖洗10 min以除去多余染液，蒸餾水沖洗后用95%(體積分數(shù))乙醇脫水5 s，伊紅染色液染色30 s，用95%(體積分數(shù))乙醇脫水2 min，新?lián)Q95%(體積分數(shù))乙醇再度脫水2 min，二甲苯透明5 min，新?lián)Q二甲苯再度透明5 min，中性樹膠封片。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)的運動行為

6-OHDA注射后第10天進行阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠單側(cè)旋轉(zhuǎn)實驗，以大于60 r/30 min為成模標準，剔除旋轉(zhuǎn)不達標的動物，Sham組給予同樣劑量阿撲嗎啡。PD大鼠分為Model組、DMS-δ組、DMS-γ組，3組動物分組較均衡，保證了DMS治療前疾病的進展基本處于同一水平，詳見表2。

表2 動物分組及阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為

DMS: deep-brain magnetic stimulation; DMS-δ: δ rhythm DMS treatment; DMS-γ: γ rhythm DMS treatment.

2.2 DMS-γ治療改善了PD大鼠的運動行為

碰壁實驗用來測量動物在做探索性運動時左右雙前肢的利用率，是反映單側(cè)6-OHDA損傷PD模型雙側(cè)肢體不對稱運動行為的指標。結(jié)果顯示，在治療過程中，Model組大鼠傷側(cè)前肢利用率由20.91%下降到16.13%，而DMS-γ組大鼠傷側(cè)前肢利用率由21.72%增加到36.45%。在治療的第2、3、4周，DMS-γ組大鼠傷側(cè)前肢利用率相對于Model組顯著增高(圖2)。使用重復測量數(shù)據(jù)方差分析顯示DMS-γ組和Model組差異具有統(tǒng)計學意義(P= 0.032)。

圖2 伽馬節(jié)律深部腦磁刺激改善了6-OHDA大鼠的運動癥狀

2.3 DMS治療對大鼠體質(zhì)量的影響

DMS治療的第0、1、2、3、4周，各組動物的體質(zhì)量均逐漸增加(F時間= 665.38，P時間<0.001)，但各組間動物體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(F組間=0.93，P組間= 0.44)(圖3)。

2.4 DMS治療對大鼠外周血淋巴細胞亞群計數(shù)的影響

DMS治療4周后，應用流式細胞術(shù)進行外周血細胞亞群的分類及數(shù)量測定。實驗結(jié)果顯示，各組大鼠外周血總淋巴細胞數(shù)占總血細胞數(shù)的比例差異無統(tǒng)計學意義(F= 0.56,P= 0.64)(圖4A)。各組大鼠總T細胞數(shù)占總淋巴細胞數(shù)的比例差異無統(tǒng)計學意義(F= 1.60,P= 0.22)(圖4A)。DMS-δ組NK細胞計數(shù)及占總淋巴細胞比例顯著低于Model組(P< 0.05)(圖4B)，而B細胞計數(shù)及占總淋巴細胞比例顯著高于Model組(P< 0.05)(圖4B)。DMS-γ組與Model組相比NK細胞計數(shù)及占總淋巴細胞比例、B細胞計數(shù)及占總淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4B)。各組大鼠輔助T細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(F= 2.84,P= 0.065)，相應地，各組大鼠輔助T細胞占總淋巴細胞數(shù)比例差異無統(tǒng)計學意義(F= 0.85,P= 0.49)。各組大鼠殺傷T細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(F= 1.27,P= 0.31)，殺傷T細胞占總淋巴細胞數(shù)比例差異也無統(tǒng)計學意義(F= 0.61,P= 0.62)(圖4C)。

圖3 深部腦磁刺激對動物體質(zhì)量的影響

2.5 DMS治療未造成動物主要器官的組織病理學改變

DMS治療4周后，對各組大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸進行了HE染色。染色結(jié)果顯示，各組動物器官均未發(fā)現(xiàn)明顯組織病理學異常(圖5)。

圖4 深部腦磁刺激對外周血細胞計數(shù)的影響

圖5 深部腦磁刺激治療未引起主要器官的組織病理學變化

HE staining for heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, intestines, testis were conducted after 4th week of DMS treatment to detect whether there were side effects on major organs. DMS: deep-brain magnetic stimulation; DMS-δ: δ rhythm DMS treatment; DMS-γ: γ rhythm DMS treatment; HE: hematoxylin-eosin.

3 討論

筆者在本研究中檢測了DMS對PD模型動物運動癥狀治療效果的同時，又通過關注DMS治療中有無一般不良反應來評價DMS治療的安全性。單側(cè)損毀的帕金森病大鼠表現(xiàn)出身體左右側(cè)運動行為的不對稱性。Cylinder test結(jié)果表明，相對于Model組，DMS-γ組在接受治療后表現(xiàn)出很好的恢復趨勢，在治療2周后開始表現(xiàn)出差異有統(tǒng)計學意義且一直持續(xù)到治療結(jié)束，而DMS-δ組在治療過程中相對于Model組未有顯著改善，表明DMS-γ對PD運動癥狀具有治療效果。

DMS發(fā)揮治療作用的同時，它的安全性得到了重點評估。在本研究中，動物體質(zhì)量測定[15]、外周血淋巴細胞的分類及計數(shù)[16-17]、主要組織器官HE染色[18]都是良好的評價不良反應的指標。結(jié)果表明，各組動物的體質(zhì)量逐漸增加，相對來說Model組大鼠隨疾病進展，運動量下降，后期有更明顯的增體質(zhì)量趨勢，但各組差異均無統(tǒng)計學意義，表明DMS治療未對動物的體質(zhì)量產(chǎn)生影響。除體質(zhì)量外，筆者關注了經(jīng)過持續(xù)一個月的磁刺激是否能帶來外周血淋巴細胞的損害。從淋巴細胞的分類及計數(shù)實驗結(jié)果看出，各組大鼠總淋巴細胞、總T細胞、輔助T細胞、殺傷T細胞計數(shù)比例均未表現(xiàn)出差異有統(tǒng)計學意義，相對于正常的Sham組來說，Model組NK細胞的計數(shù)及比例顯著增加，同時B細胞計數(shù)及比例也有降低趨勢。表明相對于正常動物來說，PD模型動物的T細胞介導的細胞免疫未有變化，NK細胞介導的天然免疫有增強作用而B細胞介導的體液免疫有減弱的趨勢[19-21]。兩種DMS治療均未影響總淋巴細胞、總T細胞、輔助T細胞、殺傷T細胞計數(shù)或比例，DMS-γ組也未影響NK細胞、B細胞計數(shù)及比例，提示DMS-γ組未表現(xiàn)出對外周血淋巴細胞的影響和損害；而DMS-δ組在未損害淋巴細胞的同時，改善了Model組相對于Sham組NK細胞、B細胞的變化。中樞系統(tǒng)疾病確實可能伴隨免疫反應的改變，雖然DMS-δ治療方式并未改善PD行為學，但在對淋巴細胞的影響方面或許有進一步研究的價值[22]。最后通過HE染色觀察了動物主要器官的組織病理學改變，結(jié)果顯示，此PD動物模型未表現(xiàn)出各主要器官的明顯病變，同時兩種DMS治療也未對其產(chǎn)生影響。通過上述動物體質(zhì)量測定、外周血淋巴細胞亞群數(shù)量測定、主要器官HE染色都表明DMS對PD動物運動癥狀的治療中沒有明顯的不良反應，是一種安全的治療方式。

綜上所述，DMS-γ具有改善PD動物運動行為的作用。通過體質(zhì)量測定、外周血淋巴細胞各亞群計數(shù)、主要器官的組織病理學觀察，在DMS治療中均未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應。因此，DMS技術(shù)在無創(chuàng)的PD治療中具有較好的應用前景。

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編輯 陳瑞芳

Safety evaluation during deep-brain magnetic stimulation (DMS)treating motor symptoms in Parkinsonian rats

Liu Junhua1,2,3, Wang Yong2,3,4, Wang Yanyan1,2,3,, Wang Xiaomin1,2,3*

(1.DepartmentofNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2.KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDisordersoftheMinistryofEducation,Beijing100069,China; 3.BeijingInstituteforBrainDisorders,Beijing100069,China; 4.DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective To explore the security via DMS to treat motor symptoms in hemi-parkinsonian rats.Methods Rats were injected with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into right striatum to establish unilateral parkinsonian model. Sham group received the same volume of normal saline by the same procedure. After screened via apomorphine, the successful parkinsonian rats were randomly grouped into model, δ rhythm DMS treatment (DMS-δ) and γ rhythm DMS treatment (DMS-γ). Among each DMS treatment group, 40 minutes trains of DMS were administered daily for 4 weeks. Cylinder tests were conducted to detect motor outcomes. Body weight determination, peripheral blood lymphocytes classification & counting, HE staining were executed to evaluate the security of DMS. Results ①The lesioned side forelimb usage ratio in Sham and DMS-γ groups were significantly higher than that in Model group. ②There was no significant difference of body weight between each group, indicating that DMS had no significant effects on body weight. ③There was no significant difference of the number and percentage of total lymphocytes & T cells between each group, while the natural killer (NK) cells number and percentage in DMS-δ group were significantly higher than that in Model group. ④Results of HE staining for major organs showed no significant histopathological change. Conclusion DMS-γ treatment alleviated bilateral limb asymmetry in PD rats. Meanwhile, DMS treatment showed no significant side effects, indicating that DMS showed satisfactory security in the treatment of motor symptoms in PD rats.

Parkinson’s disease; deep-brain magnetic stimulation; motor behavior; side effects; safety

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(“973”計劃)(2011CB504100)，北京市自然科學基金項目(7082008)，北京市科學技術(shù)委員會專項資助(Z161100002616007)，北京市屬高等學校創(chuàng)新團隊建設與教師職業(yè)發(fā)展計劃項目(IDHT20140514)。This study was supported by National Basic Research Program of China (“973” Fundamental Research) (2011CB504100), Natural Science Foundation of Beijing (7082008)，Beijing Municipal Science & Technology Commission (Z161100002616007)，The Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20140514).

時間：2017-04-13 20∶30

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2030.062.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.020]

R742.5

2017-03-15)

*Corresponding author， E-mail：xmwang@ccmu.edu.cn