尹建浩,張 昊,孟 磊,許 剛,周章建,張 勇,黨誠學(xué)

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科(西安 710061)

糞便SPG20、FBN1及VIM基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌診斷中的意義*

尹建浩,張 昊,孟 磊,許 剛,周章建,張 勇,黨誠學(xué)△

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科(西安 710061)

目的：探討糞便標(biāo)本的痙攣性截癱-20(SPG20)、微纖維蛋白-1(FBN1)及波形蛋白(VIM)基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌診斷及篩查中的意義。方法：選取結(jié)直腸癌患者75例為觀察組，30例健康、年齡匹配的經(jīng)結(jié)腸鏡檢查陰性者為正常對照組。提取組織及糞便標(biāo)本DNA，應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)方法檢測組織及糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1及VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。結(jié)果：結(jié)直腸癌患者癌組織中SPG20、FBN1及VIM基因啟動(dòng)子甲基化顯著高于遠(yuǎn)癌組織；結(jié)直腸癌患者糞便中SPG20、FBN1及VIM基因啟動(dòng)子甲基化顯著高于健康對照人群。聯(lián)合檢測顯示，96%的患者表現(xiàn)為至少有一個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)異常的甲基化狀態(tài)，而在健康人群中，僅有4個(gè)(13.3%)呈現(xiàn)基因的異常甲基化狀態(tài)。因此應(yīng)用SPG20、FBN1、VIM三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行篩查的敏感性為96.0%，特異性為86.7%。結(jié)論：糞便標(biāo)本的SPG20、FBN1及VIM基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌的診斷和篩查中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]，晚期結(jié)直腸癌患者5年生存率不足10%，而早期患者在90%以上，因此早期篩查能夠提高結(jié)直腸癌患者的治愈率[2-3]。腸鏡檢查雖具有較高準(zhǔn)確性，但由于腸道準(zhǔn)備、檢查不適、費(fèi)用較高等因素導(dǎo)致接受度較差。糞便隱血試驗(yàn)簡單易操作，費(fèi)用低，但敏感性及特異性均低，在結(jié)直腸癌篩查中的意義有限。所以，發(fā)展易操作、高敏感性和特異性的癌篩查手段十分必要。

痙攣性截癱-20(Spastic paraplegia-20,SPG20)基因編碼一種被稱作Spartin的多功能蛋白質(zhì)，此蛋白可能參與胞內(nèi)表皮生長因子的接受與運(yùn)輸，研究顯示在結(jié)腸癌細(xì)胞中該基因啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)異常高甲基化狀態(tài)[4-5]。微纖維蛋白(Fibrillin-1,FBN1)基因編碼的蛋白是Fibrillin家族成員之一，該基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中也表現(xiàn)啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)[5]。波形蛋白(Vimentin,VIM)基因編碼的波形蛋白屬中間纖維家族，在細(xì)胞粘附、遷移、增殖、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)及炎癥發(fā)生等多方面起著重要作用[6]。

在本研究中, 我們采用MSP方法, 聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織、正常組織標(biāo)本中，結(jié)直腸癌患者和正常人糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)并分析，探討甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌篩查方面的臨床意義。

材料和方法

1 材 料 選取就診于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的結(jié)直腸癌患者75例為觀察組。同期，選取西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的30例健康、年齡匹配的經(jīng)結(jié)腸鏡檢查陰性者為健康對照組，糞便標(biāo)本于內(nèi)鏡檢查前收集。結(jié)直腸癌患者的癌組織、遠(yuǎn)癌組織標(biāo)本，糞便標(biāo)本收集分裝后迅速置于液氮中保存。

2 研究方法

2.1 組織DNA提?。喝〖s20 mg組織標(biāo)本，按血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，中國)說明書提取組織基因組DNA，提取出來的基因組DNA保存于200 μl的TE洗脫緩沖液中，并置于-20℃冰箱中保存。

2.2 糞便DNA提?。喝〖s200 mg糞便標(biāo)本，按QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德國)說明書提取糞便基因組DNA，提取出來的基因組DNA保存于200 μl的AE洗脫緩沖液中，并置于-20℃冰箱中保存。

2.3 DNA的重亞硫酸鹽修飾：取1μg基因組DNA，使用Epi-Tect Bisulfite Kit(Qiagen，德國)試劑盒進(jìn)行基因組DNA的重亞硫酸鹽修飾和純化。產(chǎn)物迅速進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

2.4 MSP擴(kuò)增：MSP反應(yīng)體系總體積為25 μl： 重亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA樣品3 μl，2×HotStart Taq MasterMix(天根生化科技有限公司，中國)12.5 μl，無菌水7.5 μl, dNTP 1 μl, 25μM的上、下游引物各1 μl。MSP反應(yīng)條件：第1步，94℃預(yù)變性3min；第2步，94℃ 30s，相應(yīng)退火溫度30s，72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸5min。將5 μlMSP產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行處理，各組間比較采用t檢驗(yàn)，陽性率比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 結(jié)直腸癌組織中SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài) 結(jié)直腸癌患者癌組織標(biāo)本及遠(yuǎn)癌組織標(biāo)本中，SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率顯著高于遠(yuǎn)癌組織(P<0.001，表1)。進(jìn)一步對結(jié)直腸癌患者按年齡、性別、腫瘤部位、病理分期等因素進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率在不同年齡、性別、病理分期下無顯著差異。

2 糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài) 結(jié)直腸癌患者及健康對照人群糞便標(biāo)本進(jìn)行基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率顯著高于健康對照人群(P<0.001，表1)。進(jìn)一步對結(jié)直腸癌患者按年齡、性別、腫瘤部位、病理分期等因素進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率在不同年齡、性別、病理分期下無顯著差異。

表1 組織及糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1及VIM基因甲基化狀態(tài)

注: M:甲基化狀態(tài), U:非甲基化狀態(tài)

3 聯(lián)合檢測在結(jié)直腸篩查中的效率 應(yīng)用糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1、VIM三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行聯(lián)合評(píng)估，當(dāng)有一個(gè)基因啟動(dòng)子呈現(xiàn)甲基化既判定為陽性。綜合對所有結(jié)直腸患者及健康對照人群進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，96%的患者表現(xiàn)為至少有一個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)異常的甲基化狀態(tài)，而在健康對照人群中，僅有4個(gè)(13.3%)呈現(xiàn)基因的異常甲基化狀態(tài)。因此應(yīng)用SPG20、FBN1、VIM三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行篩查的敏感性為96.0%，特異性為86.7%。

討 論

中國結(jié)直腸癌中有50%的患者在手術(shù)后5年會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[7]，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率正逐年上升，且流行病學(xué)亦呈現(xiàn)部分與西方發(fā)達(dá)國家相類似的特征，早期篩査對發(fā)現(xiàn)癌前病變和早期癌癥具有重要意義。糞便中腫瘤標(biāo)志物的檢測作為結(jié)直腸癌患者的篩查手段已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外科研或臨床工作者的重視，也因其非侵入性、易操作性和費(fèi)用低而易于被受試人群所接受。某些基因在腫瘤組織和正常組織甲基化程度存在明顯的差異，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中脫落隨糞便排出，這為糞便中基因甲基化檢測應(yīng)用于結(jié)直腸癌篩查提供了可能[8]。然而不同抑癌基因啟動(dòng)子在結(jié)直腸癌患者中的甲基化發(fā)生率差異較大，并且由于樣本量、檢測手段等因素的影響，同一基因在不同的研究中表現(xiàn)出的靈敏度和特異度也存在一定的差異，作為疾病篩查手段，尤其是針對惡性腫瘤這類疾病，足夠的敏感度和特異度是非常重要的[9]。

在本研究中，我們分別檢測了結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織、正常組織標(biāo)本中，結(jié)直腸癌患者和正常人糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，結(jié)果表明三者在腫瘤組織中甲基化發(fā)生率與遠(yuǎn)癌組織相比均存在顯著性差異，并且在結(jié)直腸癌患者的糞便中基因啟動(dòng)子異常甲基化狀態(tài)的檢出率顯著高于健康對照人群。

同時(shí)通過基因聯(lián)合檢測的結(jié)果可知， SPG20、FBN1、VIM三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行篩查的敏感性為96.0%，特異性為86.7%。這表明聯(lián)合檢測基因甲基化的敏感性較單基因檢測有所提高，但特異性將降低。另外，糞便中三個(gè)基因甲基化狀態(tài)與患者的性別、年齡、腫瘤TNM分期無相關(guān)性，因此，聯(lián)合檢測不僅能夠發(fā)現(xiàn)晚期的結(jié)直腸癌患者，同時(shí)也不會(huì)漏診早期患者，這對腫瘤疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療具有重要的意義。

因此，糞便標(biāo)本中SPG20、FBN1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合檢測分析可能成為結(jié)直腸癌患者無創(chuàng)篩查的一項(xiàng)重要的、可行的方法。

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R,etal. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. International Journal of Cancer, 2015, 136(5): E359-E386.

[2] Siegel R, Ward E, Brawley O,etal. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J]. CA Cancer J Clin , 2011,6l(4): 212-236.

[3] Issa JP. CpG island methylator phenotype in cancer[J]. Nat Rev Cancer，2004,4:988.

[4] Bakowska JC, Jupille H, Fatheddin P,etal.Troyer syndrome protein spartin is mono-ubiquitinated and functions in EGF receptor trafficking[J]. Molecular Biology of the cell,2007，18: 1683.

[5] Lind G, Raiborg C, Danielsen S,etal. SPG20, a novel biomarker for early detection of colorectal cancer,encodes a regulator of cytokinesis[J]. Oncogene,2011,30: 3967.

[6] Zou H, Harrington J J, Shire A M,etal. Highly methylated genes in colorectal neoplasia: implications for screening[J]. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 2007, 16(12): 2686-2696.

[7] 宋 斌, 劉 棟, 宋雯茜,等. 結(jié)直腸癌55例術(shù)后輔以替吉奧方案化療臨床觀察[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 45(11):1507-1509.

[8] Ahlquist DA, Shuber AP. Stool screening for colorectal cancer: evolution from occult blood to molecular markers[J]. Clinica Chimica Acta, 2002, 315(1): 157-168.

[9] Toiyama Y, Okugawa Y, Goel A. DNA methylation and microRNA biomarkers for noninvasive detection of gastric and colorectal cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2014,455(1-2): 43-57.

(收稿：2016-10-17)

Detection of hypermethylated SPG20, FBN1 and VIM in stool samples of patients with colorectal cancer

Yin Jianhao , Zhang Hao,Meng Lei,et al.

Department of Surgical Oncology, First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University College of Medicine ( Xi’an 710061)

Objective: To clarify the feasibility and clinical significance of detection of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter hypermethylation in stool samples of patients with colorectal cancer. Methods: Samples were collected from 75 patients with colorectal cancer and 30 healthy individuals in the first affiliate hospital of Xi’an Jiaotong University. The methylation status of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter in tissue and stool samples was detected using methylation-specific PCR. Results: The methylation rates of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter in cancer tissue samples were significantly higher than the distal tissue samples in patients with colorectal cancer. Also, the methylation rates of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter in stool samples of patients with colorectal cancer were significantly higher than the healthy individuals. The sensitivity and specificity of combined detection of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter methylation status in stool samples in detecting colorectal cancer were 96.0% and 86.7%, respectively. Conclusions: Multi-targets detection of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter methylation status in stool samples is a promising approach in the screening of colorectal cancer.

Colorectal Neoplasms Methylation @SPG20 @FBN1

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NSFC81372280)

結(jié)直腸腫瘤 甲基化 @痙攣性截癱-20 @微纖維蛋白-1

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.04.002

△通訊作者