馬文嫻， 郭海琴， 韓新鵬， 徐靈彬， 劉 亮， 李志超， 吳昌歸△

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 陜西 西安 710032； 2陜西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710068； 3第四軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

二甲雙胍抑制慢性哮喘小鼠氣道炎癥、重塑及新生血管形成*

馬文嫻1， 郭海琴1， 韓新鵬1， 徐靈彬2， 劉 亮1， 李志超3△， 吳昌歸1△

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 陜西 西安 710032；2陜西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710068；3第四軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

目的： 探討二甲雙胍對(duì)慢性哮喘氣道炎癥、重塑及新生血管形成的影響及可能機(jī)制。方法: 采用卵白蛋白(OVA)致敏并激發(fā)制備慢性哮喘小鼠模型，給予二甲雙胍干預(yù)，與生理鹽水對(duì)照組和慢性哮喘模型組相比，觀察支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)、外周血免疫球蛋白、氣道重塑及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白水平的變化。結(jié)果: 慢性哮喘小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞百分比較對(duì)照組升高(P<0.01)，血清OVA特異性IgE明顯升高(P<0.01)，給藥組可降低上述指標(biāo)(P<0.05)。肺組織HE染色可見氣道壁炎癥細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原沉積等病理改變，免疫組化CD31染色觀察到氣道上皮下新生血管數(shù)目和面積增加；二甲雙胍部分抑制了上述病理過程。肺組織免疫組化p-AMPK染色觀察到其在模型組氣道壁的表達(dá)較對(duì)照組下降(P< 0.05)，給藥組升高明顯(P<0.01)。結(jié)論: 慢性哮喘中AMPK磷酸化表達(dá)水平受抑制。二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK來抑制慢性哮喘氣道炎癥、重塑及新生血管的形成。

二甲雙胍； 氣道新生血管形成； 腺苷酸活化蛋白激酶； 慢性哮喘

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性氣道疾病，以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑為主要特征，伴有可變氣流受限，反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致氣道重塑，其主要病理改變包括杯狀細(xì)胞增生過分泌、氣道平滑肌(airway smooth muscle，ASM)增殖肥大、上皮下纖維化、氣道壁新生血管增多等[1]。其中，氣道黏膜下和固有層新生血管增多作為氣道重塑的重要組分，可在慢性哮喘的早期就已出現(xiàn)，且與患者的病情嚴(yán)重程度有著明顯的正相關(guān)關(guān)系[2]。因而抑制哮喘氣道新生血管形成對(duì)防治哮喘有重要意義。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細(xì)胞代謝和氧化還原的感受調(diào)節(jié)器，參與糖尿病、肥胖、心血管疾病、哮喘、腫瘤等多種疾病的發(fā)生[3]。近年研究表明AMPK活性對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物特性發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可能通過抗氧化、抗炎途徑影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，或發(fā)揮抗增殖效應(yīng)[4]。二甲雙胍(metformin，MET)作為AMPK的一種激動(dòng)劑，通過抑制線粒體呼吸，使得AMP/ATP比值增加，從而激活A(yù)MPK。近來有報(bào)道，二甲雙胍可減輕肥胖型哮喘的嗜酸性炎癥[5]，但其對(duì)慢性哮喘氣道新生血管的形成及氣道重塑的影響目前尚不清楚。本研究通過建立慢性哮喘小鼠模型，對(duì)二甲雙胍的這一作用進(jìn)行了觀察。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)6～8周雌性BALB/c小鼠(20±2) g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，該實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)室達(dá)到SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在安靜、無抗原、通風(fēng)良好的環(huán)境中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室按晝夜節(jié)律采光12 h，室溫保持在20～25 ℃，室內(nèi)濕度保持在40%～70%，小鼠可自由攝食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)遵從第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的“實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理原則”。

2 主要試劑

卵白蛋白(ovalbumin，OVA)和二甲雙胍(Sigma)；OVA特異性IgE(上海西唐生物科技)；抗CD31抗體及HRP標(biāo)記的兔抗山羊 II 抗(武漢谷歌生物科技有限公司)；抗AMPKα 兔單克隆抗體(CST)?？諌红F化器 (“歐姆龍”NE-C29型)；光學(xué)顯微鏡(CIC)；成像系統(tǒng)(Nikon)。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物造模及分組 將小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，即生理鹽水對(duì)照組(control組)、慢性哮喘模型組(OVA組)和二甲雙胍干預(yù)組(OVA+MET組)。造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用OVA致敏和激發(fā)制備哮喘小鼠氣道重塑模型[6]。模型組和干預(yù)組分別于第0、7天給予OVA 100 μg和Al(OH)31.5 mg混懸液腹腔注射；第21天開始超聲霧化吸入5% OVA 30 min；以后每周霧化3次，連續(xù)8周。對(duì)照組致敏和激發(fā)均給予生理鹽水，給藥方法相同。干預(yù)組于霧化前30 min給予二甲雙胍250 mg/kg腹腔注射。

3.2 血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar la-vage fluid，BALF)收集及細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 末次霧化24 h后眼球采血、行支氣管肺泡灌洗后取肺組織。通過氣管插管行支氣管肺泡灌洗，分3次緩慢注入PBS液，分別為0.6 mL、0.6 mL和0.5 mL，緩慢收集，回收率約為80%。BALF 1 500 r/min 離心8 min，收集上清液-20 ℃保存待測。細(xì)胞沉渣用0.2 mL PBS重懸，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。取100 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行離心甩片，室溫晾干后進(jìn)行Diff-Quik染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類，數(shù)200個(gè)細(xì)胞，求出各類白細(xì)胞百分比。取血后3 000 r/min 離心15 min，血清移至另一干凈Eppendorf管，-20 ℃保存待測。

3.3 小鼠血清OVA特異性IgE的測定 操作步驟嚴(yán)格按照小鼠血清OVA特異性IgE ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，在450 nm處測吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中待測指標(biāo)濃度。

3.4 氣管肺組織病理學(xué)檢查 取肺左上葉組織用多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm。HE染色觀察氣道炎癥細(xì)胞浸潤，PAS染色觀察氣道壁杯狀細(xì)胞增生，Masson’s染色觀察氣道壁膠原沉著，免疫組化CD31染色觀察氣道新生血管形成情況，免疫組化p-AMPK染色觀察氣道p-AMPK蛋白水平變化。由1位研究者在未知本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的情況下，采用半定量評(píng)分(0～4)評(píng)價(jià)支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤情況：0分為正常；1分是少量細(xì)胞浸潤；2分為一層細(xì)胞環(huán)狀浸潤；3分則是2～4層細(xì)胞形成環(huán)狀浸潤；4分是多于4層的細(xì)胞浸潤環(huán)。采用5分(0～4)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)氣道上皮細(xì)胞中PAS染色陽性細(xì)胞百分比：0分表示無杯狀細(xì)胞；1分表示<25%杯狀細(xì)胞；2分表示25%～50%杯狀細(xì)胞；3分表示50%～75%杯狀細(xì)胞；4分表示>75%杯狀細(xì)胞。再評(píng)價(jià)氣道每毫米基底膜上膠原沉著區(qū)的面積比。計(jì)數(shù)支氣管上皮下至基底膜區(qū)域新生血管數(shù)目并計(jì)算血管區(qū)域面積占基底膜區(qū)百分比。Image-Pro Plus軟件半定量分析上皮至基底膜區(qū)域內(nèi)平均吸光度=積分吸光度(IA)/目標(biāo)區(qū)域面積(area)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，均數(shù)間的多重比較采用Tukey法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物一般情況

慢性哮喘組小鼠激發(fā)過程中出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、前肢抬縮、腹肌抽搐、大小便失禁等哮喘急性發(fā)作癥狀。對(duì)照組無上述反應(yīng)，干預(yù)組與模型組表現(xiàn)相似，但程度較輕。

2 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)及外周血OVA特異性IgE的比較

對(duì)照組小鼠BALF中主要以巨噬細(xì)胞為主，偶見個(gè)別單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；慢性哮喘組BALF的細(xì)胞總數(shù)較對(duì)照組明顯增多(P<0.01)，其中以嗜酸性粒細(xì)胞百分比增多為主(P<0.01)，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比也增多(P<0.05)，巨噬細(xì)胞百分比相對(duì)減少(P<0.01)；二甲雙胍干預(yù)組細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞百分比較慢性哮喘組下降(P<0.05)，中性粒細(xì)胞百分比略有減少，巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞比例略有增加，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

慢性哮喘組OVA特異性IgE較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；二甲雙胍干預(yù)組OVA特異性IgE與模型組比較有降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Comparison of total cell counts and diffenential cell counts in BALF and OVA specific IgE levels in the serum in the 3 groups. MeanSEM.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsOVA group.

圖1 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及血清抗OVA特異性IgE水平的比較

3 肺組織普通病理學(xué)染色觀察

對(duì)照組小鼠上皮結(jié)構(gòu)完整，未見明顯氣道壁炎癥細(xì)胞浸潤、管壁增厚、膠原沉積、平滑肌層增厚等改變。慢性哮喘組小鼠支氣管黏膜皺襞增多、斷裂，支氣管和血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，上皮下膠原沉積，氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，氣道壁還可見上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增多；干預(yù)組上述改變輕微。HE染色采用炎癥細(xì)胞浸潤情況評(píng)分，發(fā)現(xiàn)慢性哮喘組小鼠肺部炎癥的病理改變程度明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，干預(yù)組炎癥明顯減輕(P<0.01)。采用PAS染色陽性細(xì)胞占?xì)獾郎掀ぜ?xì)胞百分比評(píng)分，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺部杯狀細(xì)胞增生變化明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，干預(yù)組可抑制其升高(P<0.01)。Masson’s染色發(fā)現(xiàn)哮喘組膠原沉著區(qū)在氣道每毫米基底膜上面積比較對(duì)照組增多明顯(P<0.01)，而干預(yù)組較模型組有減輕(P<0.01)，見圖2。

4 肺組織免疫組化CD31染色結(jié)果的比較

可見慢性哮喘組氣道上皮下至基底膜區(qū)域的CD31陽性細(xì)胞(胞漿示棕色為陽性細(xì)胞，黑色箭頭所示)形成管腔樣結(jié)構(gòu)，模型組氣道壁黏膜下新生血管數(shù)目和血管面積占黏膜下區(qū)域面積百分比較對(duì)照組明顯增多(P<0.01)，而干預(yù)組較模型組有減少(P<0.01)，見圖3。

5 肺組織免疫組化p-AMPK染色結(jié)果的比較

對(duì)照組小鼠p-AMPK蛋白陽性細(xì)胞(胞漿示棕色為陽性細(xì)胞，黑色箭頭所示)主要分布在支氣管上皮細(xì)胞，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞(紅色箭頭所示)、平滑肌細(xì)胞也有分布(藍(lán)色箭頭所示)；慢性哮喘組氣道壁p-AMPK相比對(duì)照組陽性細(xì)胞分布減少(P<0.05)，二甲雙胍干預(yù)后明顯升高(P<0.01)，見圖4。

Figure 2.Pathological changes of lung tissues from each group (HE staining, PAS staining and Masson’s staining) and comparison of peribronchial inflammation score, goblet hyperplasia and collagen deposit in the airway. The scale bar=100 μm. MeanSEM.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsOVA group.

圖2 各組小鼠肺組織病理染色及氣道炎癥評(píng)分、杯狀細(xì)胞增生評(píng)分、膠原沉著的比較

Figure 3.Immunostaining for CD31 to identify vessels and comparison of number of vessels per square millimeter of submucosa and percentage vascular area in the submocosa of the airway. Black arrows show blood vessels stained with CD31. The scale bar=50 μm. MeanSEM.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsOVA group.

圖3 各組小鼠肺組織免疫組化CD31染色及支氣管上皮下至基底膜區(qū)CD31標(biāo)記新生血管數(shù)目和面積的比較

Figure 4.Immunostaining for p-AMPK to compare the activation of AMPK in the 3 groups. p-AMPK positive cells were epithelial cells, endothelial cells and airway smooth muscle cells, which were indicted by black arrows, red arrows and blue arrows, respectively. The scale bar= 100 μm. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsOVA group.

圖4 各組小鼠肺組織免疫組化p-AMPK染色其表達(dá)水平比較

討 論

氣道炎癥和重塑在哮喘的發(fā)病中均有重要意義，目前臨床上治療哮喘的藥物并不能有效地改善氣道重塑，故尋求能同時(shí)減輕氣道炎癥及重塑的新途徑一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。慢性哮喘氣道粘膜下新生血管的形成增多是氣道重塑中的一個(gè)重要特征[2]。哮喘氣道上皮下微血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能異常(血管密度、血管面積百分比及血管通透性增加)，是氣道持續(xù)性炎癥、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞異常增殖分化及肺功能降低的潛在原因，也是聯(lián)系氣道炎癥和重塑的關(guān)鍵[7]。血管形成增多受多個(gè)因素的調(diào)控，除了促血管因子和抑血管因子的失衡外，研究表明局部代謝狀態(tài)的變化(如低氧、營養(yǎng)不足)也將促進(jìn)血管新生[8]。AMPK是一種廣泛表達(dá)且高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要是通過肝臟激酶B1(liver kinase B1，LKB1)、轉(zhuǎn)化生長因子β激活性激酶1(transforming growth factor beta-activated kinase 1，TAK1)、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶激酶β(calmodulin-de-pendent protein kinase kinase β，CaMKKβ) 磷酸化AMPK Thr172位點(diǎn)，或經(jīng)AMP/ATP變構(gòu)調(diào)節(jié)被激活[9]。AMPK作為細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)器，不僅調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抗炎，還可以抑制多種非惡性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖[10-11]。二甲雙胍除了用于II型糖尿病的降血糖治療外，還被證實(shí)能通過激活A(yù)MPK發(fā)揮抗炎、抗增殖效應(yīng)來抑制組織炎癥和組織重塑[11]。

多篇文獻(xiàn)報(bào)道二甲雙胍可以通過降低黏附分子和炎癥因子的表達(dá)，從而減少炎癥細(xì)胞遷移，發(fā)揮抗炎作用[12-13]。Calixto等[5]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能抑制高脂誘導(dǎo)的肥胖型哮喘小鼠BALF中炎性細(xì)胞的滲出；Park等[14]在OVA和真菌相關(guān)變應(yīng)原蛋白誘導(dǎo)哮喘小鼠中也觀察到此現(xiàn)象。本研究也在成功復(fù)制的慢性哮喘模型小鼠中有類似發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠降低BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例及血清OVA-IgE水平；并且HE染色顯示二甲雙胍也減輕了支氣管周圍炎癥。另外，多個(gè)研究表明二甲雙胍在組織重塑發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)節(jié)的作用，它能抑制心肌重塑、血管重塑、腎臟纖維化等[15-16]。我們建立的慢性哮喘模型小鼠肺組織染色也提示二甲雙胍減輕了杯狀細(xì)胞增生及膠原沉積等氣道重塑病理改變。

近年來，關(guān)于二甲雙胍對(duì)血管結(jié)構(gòu)和功能的研究日益增多。多項(xiàng)研究表明二甲雙胍可以抑制腫瘤血管的生成從而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[17]；體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)二甲雙胍可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及成管[4]。此外，Jian等[18]還觀察到二甲雙胍激活A(yù)MPKα1改善了急性肺損傷模型中的微血管損傷。哮喘氣道黏膜下新生血管發(fā)生增多，將使血漿滲出增多，加速炎癥細(xì)胞的遷移和募集，加重氣道炎癥；新生血管的增多將引起營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子供應(yīng)增多，導(dǎo)致組織生長異常、細(xì)胞行為異常和高活性狀態(tài)，如氣道平滑肌細(xì)胞增生肥大、成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和黏液腺增生過分泌等，這些結(jié)構(gòu)性變化致使持續(xù)性氣道高反應(yīng)性發(fā)生和發(fā)展[7]。故而研究二甲雙胍對(duì)慢性哮喘新生血管生成方面的作用將為哮喘的臨床治療提供新的線索。本實(shí)驗(yàn)采用血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31來顯示新生的血管內(nèi)皮，觀察二甲雙胍對(duì)慢性哮喘新生血管生成方面的作用，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍干預(yù)后氣道上皮下區(qū)域新生血管數(shù)目和面積較哮喘組明顯減少，提示二甲雙胍能抑制哮喘氣道新生血管的形成。此外，我們的研究證實(shí)了慢性哮喘組p-AMPK表達(dá)水平較正常組降低，二甲雙胍能使其明顯升高。這些結(jié)果提示：二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK抑制炎癥因子和血管生成因子的合成與釋放或?qū)?nèi)皮細(xì)胞增殖的直接抑制影響氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展，有關(guān)這一機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，二甲雙胍既可減輕氣道炎癥及重塑，又抑制了氣道新生血管的形成，對(duì)慢性哮喘的治療有一定的潛在臨床應(yīng)用前景。AMPK及其信號(hào)通路有望成為治療哮喘的藥理學(xué)靶點(diǎn)。

[1] Saglani S, Lloyd CM. Novel concepts in airway inflammation and remodelling in asthma[J]. Eur Respir J, 2015, 46(6):1796-1804.

[3] Mihaylova MM, Shaw RJ. The AMPK signalling pathway coordinates cell growth, autophagy and metabolism[J]. Nat Cell Biol, 2011, 13(9):1016-1023.

[4] Peyton KJ, Liu XM, Yu Y, et al. Activation of AMP-activated protein kinase inhibits the proliferation of human endothelial cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2012, 342(3): 827-834.

[5] Calixto MC, Lintomen L, André DM, et al. Metformin attenuates the exacerbation of the allergic eosinophilic inflammation in high fat-diet-induced obesity in mice[J]. PLoS One, 2013, 8(10): e76786.

[6] Kumar RK, Herbert C, Foster PS. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice[J]. Curr Drug Targets, 2008,9(6): 485-494.

[7] Harkness LM, Ashton AW, Burgess JK. Asthma is not only an airway disease, but also a vascular disease[J]. Pharmacol Ther, 2015, 148: 17-33.

[8] Potente M, Gerhardt H, Carmeliet P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis[J]. Cell, 2011, 146(6):873-887.

[9] Hardie DG. Molecular pathways: is AMPK a friend or a foe in cancer?[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21(17):3836-3840.

[10]Wang G, Song Y, Feng W, et al. Activation of AMPK attenuates LPS-induced acute lung injury by upregulation of PGC1α and SOD1[J]. Exp Ther Med, 2016,12(3): 1551-1555.

[11]Vincent EE, Coelho PP, Blagih J, et al. Differential effects of AMPK agonists on cell growth and metabolism[J]. Oncogene, 2014, 34(28):3627-3639.

[12]Hattori Y, Suzuki K, Hattori S, et al. Metformin inhibits cytokine-induced nuclear factor κB activation via AMP-activated protein kinase activation in vascular endothelial cells[J]. Hypertension, 2006, 47(6):1183-1188.

[13]Victor VM, Rovira-Llopis S, Banuls C, et al. Metformin modulates human leukocyte/endothelial cell interactions and proinflammatory cytokines in polycystic ovary syndrome patients[J]. Atherosclerosis, 2015, 242(1):167-173.

[14]Park CS, Bang B, Kwon H, et al. Metformin reduces airway inflammation and remodeling via activation of AMP-activated protein kinase[J]. Biochem Pharmacol, 2012, 84(12):1660-1670.

[15]Burla AK, Lobato NS, Fortes ZB, et al. Cardiac fibrosis and vascular remodeling are attenuated by metformin in obese rats[J]. Int J Cardiol, 2013, 165(3):483-487.

[16]Shen Y, Miao N, Xu J, et al. Metformin prevents renal fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction and inhibits Ang II-induced ECM production in renal fibroblasts[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(2):146.

[17]Kannarkatt J, Alkharabsheh O, Tokala H, et al. Metformin and angiogenesis in cancer revisited[J]. Oncology, 2016, 91(4):179-184.

[18]Jian MY, Alexeyev MF, Wolkowicz PE, et al. Metformin-stimulated AMPK-1 promotes microvascular repair in acute lung injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2013, 305(11):L844-L855.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Metformin inhibits airway inflammation, remodeling and neovascularization in asthma mice

MA Wen-xian1, GUO Hai-qin1, HAN Xin-peng1, XU Ling-bin2, LIU Liang1, LI Zhi-chao3, WU Chang-gui1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;3DepartmentofPathophysiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:changgui@fmmu.edu.cn;lizhic@fmmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of metformin on airway inflammation, remodeling and neovascularization in a mouse model of chronic asthma and its possible mechanisms. METHODS: BALB/c mice were randomly divided into saline group, ovalbumin (OVA) group and OVA+metformin group, with 8 in each. At the end of OVA exposure, blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were collected for the measurement of OVA specific IgE and leukocyte counts. Lung tissue sections were stained with hematoxylin-eosin, periodic acid-Schiff and Masson’s trichrome to detect inflammatory cell infiltration, goblet cell hyperplasia, and collagen deposition around the airway, respectively. Immunohistochemistry was used to evaluate the number and percentage area of new blood vessels (CD31+), and the protein level of phosphorylated AMP-activated protein kinase (p-AMPK) in the airway. RESULTS: Compared with saline group, the eosinophil percentage and OVA specific IgE in serum in OVA group were all increased obviously (P<0.01). Metformin inhibited the above increases (P<0.05). Compared with control group, a marked increase in inflammation infiltration, PAS+cells and collage deposition in the airway mucosa in OVA group were observed. Metformin partially relieved the above changes. CD31+vessels in the wall of bronchi showed the abundance of blood vessels observed in OVA group compared with control group, which was suppressed by the treatment with metformin (P<0.05). The protein level of p-AMPK was reduced in the lung tissue challenged with OVA as compared with control group (P<0.05), while metformin increased the protein level of p-AMPK (P<0.01). CONCLUSION: The protein level of p-AMPK in the airway in OVA group is attenuated. Metformin effectively inhibits airway inflammation, remodeling and neovascularization possibly via activating AMPK signaling pathway.

Metformin; Airway neovascularization; AMP-activated protein kinase; Chronic asthma

1000- 4718(2017)04- 0590- 06

2016- 12- 06

2017- 03- 01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81470223)

R562.2+5； R965； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.003

△通訊作者 吳昌歸 Tel： 029-84774194； E-mail： changgui@fmmu.edu.cn； 李志超 Tel： 029-84772705； E-mail： lizhic@fmmu.edu.cn