趙辛元， 徐 魁， 李彩容， 李 娟， 林鳳平， 李彩艷， 孫家忠, 陳 曉

(1湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科, 2咸寧市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 咸寧 437100； 3武漢大學(xué)中南醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430071； 4湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 咸寧 437100)

川芎嗪通過抗炎作用減輕2型糖尿病大鼠心肌病變*

趙辛元1， 徐 魁1， 李彩容1， 李 娟1， 林鳳平2， 李彩艷2， 孫家忠3, 陳 曉4△

(1湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科,2咸寧市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 咸寧 437100；3武漢大學(xué)中南醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430071；4湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 咸寧 437100)

目的： 觀察川芎嗪對抗糖尿病引起的大鼠心肌細(xì)胞損傷的作用。方法: 雄性Wistar大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后空腹自尾靜脈注射STZ制造2型糖尿病模型，觀察不同給藥劑量川芎嗪對糖尿病大鼠體重、血糖、心臟組織形態(tài)以及心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IKKβ和NF-κB蛋白水平的影響。結(jié)果: 高劑量川芎嗪可緩解糖尿病大鼠的體重減輕和血糖升高，并且可以減少促炎因子 IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，降低IKKβ和NF-κB的蛋白水平。結(jié)論: 川芎嗪通過拮抗炎癥通路能減輕糖尿病引起的大鼠心肌細(xì)胞損傷。

川芎嗪； 心肌炎癥； 2型糖尿病

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種常見的獨(dú)立于其它發(fā)病因素的糖尿病(diabetes mellitus，DM)慢性并發(fā)癥，也是導(dǎo)致糖尿病患者心血管疾病的一個重要的原因[1]。DCM的臨床表現(xiàn)早期主要為左心室舒張功能障礙，晚期為收縮功能障礙，并且可以誘發(fā)心源性休克、心力衰竭和猝死等[2]。DCM的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由糖、脂代謝紊亂導(dǎo)致的，其中氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體損傷等在DCM的發(fā)病機(jī)制中具有重要地位，而氧化應(yīng)激和炎癥機(jī)制更受關(guān)注[3]，因此有許多研究將DCM的治療方向選在抗炎、抗氧化上[4-5]。川芎嗪是從傘形科藁本屬植物川芎根中提取的生物堿，目前應(yīng)用于臨床的有川芎嗪片、川芎嗪注射劑等，具有廣泛的藥理活性[6]。諸多研究表明川芎嗪具有良好的對心腦血管的保護(hù)作用如防治腦缺血、抗血栓、抗腫瘤以及對心臟心肌細(xì)胞和冠狀動脈的防治效果[7-8]。雖然近年來川芎嗪通過清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化的作用機(jī)制來產(chǎn)生藥理活性的報(bào)道屢見報(bào)到，但文獻(xiàn)多集中在腫瘤[9]、高血壓[10]、腦中風(fēng)[11]等方面，而對糖尿病引起病變的改善作用研究較少。即使川芎嗪在糖尿病人和動物水平上都具有治療作用[12-15]，但是甚少研究關(guān)注到其改善糖尿病所引起的心臟病變。本實(shí)驗(yàn)將從炎癥因子方向來探討川芎嗪對DCM的防治作用及可能機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑與儀器

川芎嗪(純度98%，上海晶純)、羧甲基纖維素鈉和鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自優(yōu)寧維生物有限公司；抗IKKβ和NF-κB抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(武漢谷歌生物科技有限公司)；檢測IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子的ELISA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

血糖儀(深圳市三諾電子有限公司)；電泳儀和電泳槽(北京六一公司)；全波長多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)；熒光掃描儀(奧德賽)；3-18K高速冷凍離心機(jī)(Sigma)；正置顯微鏡(Olympus)。

2 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠共50只，體重120～150 g，動物合格證為編號SYXK(鄂)2013-0071，伺養(yǎng)于SPF級動物房。維持正常的室溫和光照12 h的晝夜節(jié)律。正常組給予普通飼料，常規(guī)飲水、進(jìn)食。模型組和川芎嗪組給予高糖高脂喂養(yǎng)和常規(guī)飲水。

3 方法

3.1 糖尿病模型制備 用0.1 moL/L的枸櫞酸緩沖液(pH 4.2)在冰浴中配制10 g/L的STZ溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。給禁食12 h 后的大鼠尾靜脈注射STZ(25 mg/kg)。注射完7 d后測血糖，若餐后餐前血糖小于6.1 mmoL/L和2 h血糖大于11.2 mmoL/L，且有多飲、多食、多尿現(xiàn)象者，確定為糖尿病大鼠。

3.2 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理 隨機(jī)選擇10只健康雄性Wistar大鼠為正常(normal, Nor)組，30 只造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為3 組，分別為糖尿病模型組(DM組)、川芎嗪高劑量治療組(High組)和低劑量治療組(Low組)。川芎嗪用1% 的羧甲基纖維素鈉助溶。各治療組分別以50和100 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃1次?？瞻捉M和模型組，每日以等體積1%的羧甲基纖維素鈉灌胃1 次。于給藥16 周末空腹12 h后測定空腹血糖和餐后血糖，每周進(jìn)行體重監(jiān)控。16周后，苯巴比妥鈉麻醉，開胸取心臟，一部分用4% 多聚甲醛固定，用于HE 染色；另一部分凍存在-80 ℃冰箱，用于Western blot 檢測和ELISA分析。

3.3 心肌組織結(jié)構(gòu)的觀察 4%多聚甲醛固定心肌組織24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備4 μm 石蠟切片，常規(guī)HE 染色，中性樹脂封片，光鏡顯微鏡下觀察分析心肌組織病理變化。

3.4 ELISA試劑盒檢測心肌組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量 剪取體積約100 mg的心肌組織，加入1 mL 生理鹽水，勻漿器勻漿后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，按ELISA 試劑盒說明書操作，450 nm 波長下檢測吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子的含量。

3.5 Western blot 檢測IKKβ和NF-κB蛋白表達(dá) 從-80 ℃冰箱取100 mg 凍存的心肌組織，稱重，按照質(zhì)量體積比1∶10加入1 mL RIPA 裂解液(含1 mmoL/L PMSF)，冰上快速用剪刀剪碎成小團(tuán)塊，用超聲波粉碎儀粉碎30 s，冰上靜置30 s，重復(fù)3次后，靜止30 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清于另一EP管中。用BCA 法進(jìn)行蛋白含量測定，根據(jù)所需樣品體積，加5×SDS 上樣緩沖液， 沸水加熱8 min，使蛋白變性。制作10%分離膠和5%的濃縮膠，取60 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% BSA封閉1 h，加入適量比例的抗體，4 ℃過夜孵育，然后，孵育相應(yīng)的熒光 II 抗1 h，同樣TBST洗膜3次，熒光掃描得到目的條帶。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey’s檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 川芎嗪對大鼠體重和血糖的影響

與糖尿病大鼠相比，High組大鼠體重顯著增加(P<0.05)，并且與正常組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；糖尿病組與正常組比較，體重顯著降低(P<0.01)。同樣，在血糖水平上，與糖尿病組比較，高劑量川芎嗪組具有明顯降低餐后血糖的作用(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The body weight and blood glucose of the rats were detected. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsNor group;#P<0.05vsDM group.

圖1 川芎嗪對糖尿病大鼠體重和血糖的影響

2 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟形態(tài)學(xué)的影響

觀察糖尿病大鼠心肌細(xì)胞組織HE染色切片，發(fā)現(xiàn)Nor組心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)清晰可見；DM組心肌細(xì)胞形態(tài)上出現(xiàn)紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞連接不緊密；隨著藥物劑量從低劑量到高劑量，細(xì)胞間隙逐漸減少，細(xì)胞排列較整齊，形態(tài)比較均一,見圖2。

3 Western blot檢測川芎嗪對IKKβ和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與正常組相比，糖尿病大鼠心臟組織中IKKβ和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與DM組比較，川芎嗪組劑量依賴性地降低了IKKβ和NF-κB蛋白表達(dá)(P<0.05)。

4 川芎嗪對心臟炎癥因子的影響

DM組IL-6和IL-1β的水平明顯增加(P<0.01)，而川芎嗪劑量依賴性地降低了IL-6和IL-1β的表達(dá)，高劑量組與糖尿病模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與正常組相比，糖尿病大鼠心臟中的TNF-α明顯增加(P<0.01)，而高劑量川芎嗪具有明顯降低TNF-α表達(dá)的作用(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The changes of myocardial structure in different groups (HE staining, ×200).

圖2 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響

Figure 3.The modulation of ligustrazine on the expression of IKK and NF-κB in different groups. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNor group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

圖3 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟IKKβ和NF-κB的調(diào)控

Figure 4.Effect of ligustrazine on inflammatory cytokines in different groups. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsNor group;#P<0.05vsDM group.

圖4 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟炎癥因子的調(diào)控

討 論

糖尿病業(yè)已成為一種繼心腦血管、腫瘤之后嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全的第三大殺手[16]。糖尿病引起的并發(fā)癥在糖尿病的致死和致殘過程中起到舉足輕重的作用。越來越多由糖尿病引起的心肌病得到全世界科學(xué)家們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道[17]，長期的糖尿病狀態(tài)具有提高心肌氧化應(yīng)激和炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。同時，高糖刺激過多的ROS生成也引起多種炎癥因子表達(dá)升高[18-19]，如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及炎癥小體等，在胞漿中NF-κB通過與抑制蛋白IκB的結(jié)合，以無活性的形式存在。大部分NF-κB 的激活有賴于IκB的磷酸化和泛素化。IκB是首先被IKK(IκB激酶)所磷酸化，然后快速泛素化繼而被26S蛋白酶體所降解。降解會解離出NF-κB，導(dǎo)致胞漿中NF-κB濃度升高。游離的NF-κB轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，生成相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)[20]。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病組IKK和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高，涉及到NF-κB可能被激活。相反，在糖尿病狀態(tài)下，川芎嗪可以劑量依賴地逆轉(zhuǎn)激活反應(yīng)。目前在糖尿病心肌病中發(fā)現(xiàn)的炎癥小體很多，其中NLRs家族中的NLRP3尤為值得關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)caspase-1的自我剪切，形成活性的caspase-1 p20/p10復(fù)合物，促進(jìn)IL-1β的釋放。后者在心肌細(xì)胞的凋亡過程中起到重要的作用。同時[21]，高糖環(huán)境下的ROS也會促進(jìn)IL-6和TNF-α的表達(dá)上調(diào)。在這過程中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB具有間接的橋梁作用，通過轉(zhuǎn)錄促進(jìn)炎癥小體過度激活，導(dǎo)致心肌間質(zhì)炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化等發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中， DM組炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α的釋放均出現(xiàn)顯著增加。這些表明在糖尿病狀態(tài)下，炎癥信號通路可能被激活。而川芎嗪顯著降低了炎癥因子的釋放水平，特別是高劑量組，對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞起到明顯的保護(hù)作用。

大量研究已經(jīng)表明川芎嗪對心血管系統(tǒng)的具有防治保護(hù)作用[22-23]，可以抑制AngⅡ引起的心肌細(xì)胞凋亡，抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的外鈣內(nèi)流和肌漿網(wǎng)的內(nèi)鈣釋放，來避免心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平，保護(hù)心肌的作用。但是對川芎嗪降低高血糖所導(dǎo)致的炎癥方面的研究甚少。本課題試圖從炎癥因子相關(guān)途徑來闡述川芎嗪對大鼠糖尿病的有益作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎嗪不僅可以降低血糖、維持大鼠體重；組織形態(tài)上劑量依賴性地改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，恢復(fù)組織間隙，使細(xì)胞排列整齊，形態(tài)均一；還可以抑制心肌細(xì)胞中的炎癥因子的含量，降低炎癥信號通路中的IKKβ和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，從而表現(xiàn)出對糖尿病心肌炎的治療作用。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of ligustrazine on cardiac inflammation in rats with type 2 diabetes mellitus

ZHAO Xin-yuan1, XU Kui1, LI Cai-rong1, LI Juan1, LIN Feng-ping2, LI Cai-yan2, SUN Jia-zhong3, CHEN Xiao4

(1DepartmentofEndocrinology,HubeiUniversityofScienceandTechnologyClinicalMedicalCollege,2DepartmentofEndocrinology,CentralHospitalofXianningCity,Xianning437100,China;3DepartmentofEndocrinology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China;4HubeiProvincalKeyLaboratoryforDiabeticCardiovascularandCerebrovassularDiseases,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning437100,China.E-mail:gxzpwk69@126.com)

AIM: To study the effect of ligustrazine on the cardiacmyocyte lesion in rats with type 2 diabetes mellitus. METHODS: Male Wistar rats were injected with STZ via tail vein under high-glucose and high-fat feeding for 4 weeks to establish the animal model of type 2 diabetes mellitus. Ligustrazine at different doses was used to treat the diabetic rats. The body weight, blood glucose and the morphology of heart tissues were observed. The myocardial levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were detected by ELISA, and the protein expression of IKKβ and NF-κB in the myocardium was determined by Westeren blotting. RESULTS: Ligustrazine at high dose alleviated the body weight reduction and blood glucose elevation cause by diabetes, and reduced pro-inflammatory factors IL-1β, TNF-α and IL-6. Moreover, the protein expression of IKKβ and NF-κB was significant decreased by ligustrazine. CONCLUSION: Ligustrazine inhibits the myocardial inflammation caused by diabetes through anti-inflammatory pathway.

Ligustrazine; Myocardial inflammation; Type 2 diabetes mellitus

1000- 4718(2017)04- 0744- 05

2016- 10- 10

2016- 12- 19

湖北科技學(xué)院校級科研項(xiàng)目(No. KY14068)

R363； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.028

△通訊作者 Tel: 0715-8236051; E-mail: gxzpwk69@126.com