巴青松，張改生，李桂萍，張根生，周麗娟，宋運賢，陳 楚，傅兆麟

(1.淮北師范大學生命科學學院/資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽淮北 235000；s2.西北農林科技大學農學院/陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室，陜西楊凌712100)

赤霉素與小麥生理型雄性不育的關系

巴青松1，張改生2，李桂萍1，張根生1，周麗娟1，宋運賢1，陳 楚1，傅兆麟1

(1.淮北師范大學生命科學學院/資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽淮北 235000；s2.西北農林科技大學農學院/陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室，陜西楊凌712100)

為探究赤霉素與小麥生理型雄性不育的關系，以新型小麥化學殺雄劑SQ-1 作為誘導劑，西農1376為材料，構建了西農1376 不育和可育生理系，通過掃描電鏡、熒光定量PCR、氣相質譜等技術，研究了小孢子花粉形態(tài)、TaGAMYB和 CYP709C1基因表達、硬脂酸和赤霉素含量和花粉育性。結果表明，化學殺雄劑SQ-1 誘導的生理型雄性不育系花粉?；危琓aGAMYB和 CYP709C1基因表達量顯著下降，硬脂酸含量顯著上升，赤霉素含量顯著低于可育系。赤霉素對雄性不育系的育性有一定逆轉效應。

小麥；生理型雄性不育；赤霉素；花粉壁

大量研究表明，植物雄性不育系的內源激素含量與保持系顯著不同[1-4]。王華忠等[5]研究認為，油菜細胞質不育系的赤霉素含量顯著低于保持系。李英賢[6]研究發(fā)現(xiàn)，小麥K型細胞質雄性不育與花藥組織赤霉素含量有密切關系。赤霉素的生理功能主要是依靠赤霉素在植物體內的信號轉導來實現(xiàn)。GAMYB(Gibberellic acid v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)是受GA(Gibberellic acid)誘導的MYB類轉錄因子，GAMYB蛋白通過結合到GA應答基因的啟動子上來誘導下游基因的表達,在植物種子萌發(fā)、莖的伸長、開花和花藥的發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用[7]。Fiona等[8]研究發(fā)現(xiàn),隨著大麥HvGAMYB基因表達量的上升,花藥長度變小，這種現(xiàn)象和過量施用GA的植株表型相似；轉基因大麥中，HvGAMYB蛋白比野生大麥高4倍以上可導致雄性不育現(xiàn)象。Zhang等[9]研究認為，黃瓜的CsGAMYB基因只在花藥中表達，調控花粉育性。Kaneko等[10]發(fā)現(xiàn)水稻OsGAMYB基因缺失可導致花藥和花粉發(fā)育異常。OsGAMYB能夠通過調控脂肪酸羥基化影響花粉壁的形成[11]。由此可見，花藥中GAMYB基因能夠調控脂肪酸代謝，進而影響花粉壁的形成。

TaGAMYB(AY615200.1)是小麥赤霉素誘導的GAMYB轉錄因子，此基因異常表達導致小麥育性大幅下降[12]。 CYP709C1是目前發(fā)現(xiàn)的小麥中唯一催化18C脂肪酸羥基化酶基因，在小麥花粉發(fā)育中，可能受TaGAMYB轉錄因子調控，能夠合成花粉壁前體[13]。然而，赤霉素誘導的TaGAMYB基因在小麥生理型雄性不育中的作用還少見報道。目前，對于赤霉素在雄性不育中的作用，主要集中于不同作物遺傳型雄性不育小孢子發(fā)育過程中赤霉素的定量分析，對于赤霉素是否參與生理型雄性不育小麥育性轉換的調控,以及如何參與調控育性轉換都是值得研究的問題。由于單核期是SQ-1誘導的生理型雄性不育的關鍵時期[14]，本研究擬測定不育系單核期赤霉素含量、TaGAMYB和 CYP709C1基因表達水平和脂肪酸含量，分析外源赤霉素對生理型雄性不育小麥育性的影響,以期確定小麥生理型雄性不育與赤霉素的關系，為揭示雄性不育的表達調控機理積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料與設計

供試材料為小麥品種西農1376。當西農1376 生長發(fā)育至Feeke’s 8.0～8.5 時期，將其分為兩組，一組噴施化殺劑SQ-1(5.0 kg·hm-2)，誘導產生生理型不育系，簡稱為1376-CIMS，另一組噴施等量清水為對照。通過DAPI鑒定，在1376-CIMS和西農1376花藥發(fā)育到單核期進行花藥取樣，然后迅速用液氮冷凍，并保存于-80 ℃冰箱中。在成熟期通過淀粉碘化鉀實驗檢測其育性，同時，通過掃描電鏡觀察花粉形態(tài)。

1.2 方 法

1.2.1 小麥花藥總RNA提取、cDNA合成、TaGAMYB和 CYP709C1基因表達量測定

稱取約100 mg花藥，用TRNzol-A+試劑(北京天根生化科技有限公司)按說明書方法提取樣品總RNA，經核酸蛋白檢測儀和電泳檢測RNA濃度和質量。用Prim Script RT Reagent Kit 試劑盒(TaKaRa,大連)合成第一鏈cDNA，按照產品說明書進行反轉錄試驗。根據(jù)TaGAMYB(AY615200.1)和 CYP709C1基因的cDNA序列，在其保守區(qū)用Primer Premier 5.0軟件設計引物。TaGAMYB，E1-F1：5′-AATGGCAC CTTCTCTACTT-3′，E1-R1：5′-GGCGACACA CACTCCGACT-3′； CYP709C1，E1-F1：CGGAG CCAAGCCGACACT，E1-R1：GGCTGCTCAGG TCAATCT。內參為小麥18S rRNA基因，其引物為：18S-F：5′-CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3′，18S-R：5′-AACACTTCACCGGACCATTCA-3′。以花藥的cDNA 為模板，小麥18S rRNA 基因為內參進行定量PCR分析。3 次重復。PCR 反應體系20 μL ：2 μL cDNA模板，10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL，10 μL SYBR qPCR Mix，用ddH2O 補至20 μL。反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s, 32個循環(huán)；72 ℃,10 min。每個樣品的相對表達量以目的基因的表達量(目的基因/18S rRNA)除以單核期可育系的表達量(目的基因/18S rRNA)來表示，單核期可育系的相對表達量規(guī)定為1。

1.2.2 花藥脂肪酸含量的測定

氣相色譜條件：RXi-5ms毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣；程序升溫：柱初始溫度180 ℃，保溫2 min；以5 ℃·min-1速率升至280 ℃，保溫5 min；進樣口溫度280 ℃，柱流量1 mL·min-1，分流比100∶1；進樣量1 μL。質譜條件：四極質量選擇檢測器 GCMS-QP 2010，電子轟擊離子源(EI)，電子能量70eV，電子倍增器電壓1.22 kV，質量掃描范圍(m/z)為50至700，離子源溫度200 ℃，GC-MS接口溫度230 ℃，溶劑峰切除時間2 min，質譜檢測起測時間2 min。質譜圖計算機檢索數(shù)據(jù)庫NIST147。

1.2.3 花藥赤霉素含量的測定

參照王寶勤等[15]的方法進行赤霉素的提取和測定。

1.2.4 赤霉素對小麥育性轉換的影響

矮壯素是赤霉素合成的抑制劑[16]，在小孢子發(fā)育到雌雄蕊原基分化期時，對西農1376進行矮壯素處理，處理濃度為 100 μmoL·L-1；同時，對1376-CIMS進行赤霉素處理，處理濃度為0.8 mg·L-1。處理方法采用葉片涂抹法，每個處理涂抹 30 株，處理后掛牌標記。待抽穗后，套袋調查自交結實率。

2 結果與分析

2.1 小麥TaGAMYB和 CYP709C1基因的表達

通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，TaGAMYB和 CYP709C1基因在花藥單核期，在1376-CIMS中的相對表達量顯著低于西農1376(圖1)。

2.2 小麥花藥脂肪酸和赤霉素含量

氣相質譜分析結果表明，單核期1376-CIMS的硬脂酸含量顯著高于西農1376(圖3A)，表明1376-CIMS單核期的脂肪酸轉化受阻，引起花粉壁畸形(圖2A)，導致雄性不育(圖2B)。

單核期1376-CIMS花藥中赤霉素的含量顯著低于西農1376，只有對照株含量的 75.2%(圖3B)。

2.3 赤霉素和矮壯素對小麥生理型不育系育性的調控

在雌雄蕊分化期用赤霉素和矮壯素處理小麥，結果發(fā)現(xiàn)，矮壯素處理1376后，其花藥中赤霉素含量顯著降低(P<0.05)，結實率為76%，育性降低。赤霉素處理西農1376-CIMS后，花藥中赤霉素含量提高，其結實率可達12%。試驗結果證明，赤霉素信號途徑參與了小麥育性的轉換,赤霉素在花粉發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

1376：西農1376。圖柱上不同字母表示處理間差異在0.05水平顯著。下同。

1376：Xinong 1376.Different letters following data mean significant difference between treatments at 0.05 level. The same below.

圖1TaGAMYB和 CYP709C1基因在小孢子單核期的相對表達量

Fig.1 Relative expression ofTaGAMYBand CYP709C1 at single nucleus stage of microspore

3 討 論

本試驗中，可育系花藥的GA含量顯著高于不育系，結果與前人研究相同[17-18]。大麥中的GAMYB受赤霉素誘導，在花藥發(fā)育、雄蕊生長和花原基誘導等植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[10]。GAMYB表達量降低，引起下游調控育性基因 TDR、CYP703A3、CYP704B2表達量下調，導致絨氈層異常伸長，花粉壁形成受阻，證明GAMYB在水稻花藥小孢子發(fā)育和花粉壁形成中起關鍵作用[19-20]。本試驗中，不育系的TaGAMYB和 CYP709C1基因表達量顯著低于對照，引起脂肪酸積累。這是因為不育系中較低的GA 含量，使GAMYB的活性降低，導致脂肪酸轉化受阻[12]，從而嚴重影響花粉壁的正常形成。

關于外源施用赤霉素對雄性育性的轉變作用也有許多報道。張建奎等[21]研究認為，外源赤霉素能夠提高小麥溫光敏核不育系C49S的育性。Sakata等[22]研究發(fā)現(xiàn)，外施赤霉素能夠顯著提高水稻低溫誘導的雄性不育系的育性。但過高濃度的赤霉素處理也會引起植物雄性不育[23]。本研究發(fā)現(xiàn),赤霉素合成抑制劑-矮壯素可以降低小麥花粉的可育性,外施赤霉素對小麥生理型雄性不育系的育性有一定的“拯救效應”。這些研究結果說明赤霉素對小麥的育性有一定調控效應，推測其作用機制中可能存在著一種劑量依賴效應。

A:不育花粉; B:可育花粉；C:不育花粉淀粉碘染色；D:可育花粉淀粉碘染色。

A:Sterile pollen; B:Fertile pollen; C:Sterile pollen stained with KI; D:Fertile pollen stained with KI.

圖2 花粉形態(tài)和碘化鉀染色

Fig.2 Pollen morphology and potassium iodide dyeing test

圖3 西農1376和1376-CIMS的硬脂酸(A)和赤霉素(B)含量

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Relationship between Gibberellin and Chemical-Induced Male Sterility in Wheat

BA Qingsong1,ZHANG Gaisheng2,LI Guiping1,ZHANG Gensheng1,ZHOU Lijuan1,SONG Yunxian1,CHEN Chu1,FU Zhaolin1

(1.Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology/College of Life Science,Huaibei Normal University,Huaibei,Anhui 235000,China; 2.Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province/College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

The study was conducted in order to reveal the relationship between gibberellin and chemical-induced male sterility in wheat(TriticumaestivumL). Wheat variety Xinong 1376 was explored to develop physiological male sterile line through spraying SQ-1(a new chemical agent) on wheat plants at Feeke’s 8.5 stage,with the plants sprayed with same volume water as the control. Pollen morphology,TaGAMYBand CYP709C1 expression,octadecanoic acid content,and gibberellin content were analyzed via techniques such as scanning electron microscope,fluorescence quantitative PCR,gas chromatography mass spectrum at mononuclear stage. The results indicated that pollen deformity of chemical-induced male sterility generated,and expression patterns ofTaGAMYBand CYP709C1 were down-regulated significantly,and instead,octadecanoic acid content rise sharply. Meanwhile,gibberellin content was significantly lower than that of fertile line.Gibberellin have a reverse effect on sterility of male sterile lines.

Wheat; Chemical-induced male sterility; Gibberellin; Pollen wall

時間：2017-03-07

2016-08-05

2016-09-0

安徽省自然科學基金項目(1708085QC62); 安徽省高等學校省級自然科學研究項目(KJ2014B19，KJ2016A624，KJ2013A232)；淮北師范大學博士科研啟動基金項目(15600971,12601033)

E-mail：baqs1234@163.com

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)03-0344-05

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170307.1637.020.html