林三清，周中流，楊紅艷，夏敬民，楊桂珍，周良霞

（嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 湛江 524048）

·實驗研究·

檸檬桉葉總黃酮提取工藝及其清除自由基活性研究*

林三清，周中流△，楊紅艷，夏敬民，楊桂珍，周良霞

（嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 湛江 524048）

目的研究檸檬桉葉總黃酮的最佳提取工藝，測試其清除自由基活性。方法 采用正交試驗法，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、料液比及提取時間4個因素對該工藝的影響；采用體外清除自由基活性測試方法，以清除DPPH和ABTS自由基能力為指標(biāo)，評價檸檬桉葉總黃酮清除自由基的能力。結(jié)果 確定其最佳提取工藝條件，料液比為1∶15（g／mL），提取溶劑為60%乙醇，提取時間為每次1 h，提取次數(shù)為3次。按照該工藝提取檸檬桉葉總黃酮得率為0.312 7%。結(jié)論 優(yōu)選出的檸檬桉葉總黃酮最佳提取工藝條件對進一步的工藝開發(fā)有較好的參考價值，檸檬桉葉總黃酮具有較強的清除自由基能力，為開發(fā)中藥保健品提供了一定實驗室依據(jù)。

檸檬桉葉；總黃酮；提取工藝；自由基

桉樹是世界上生長最快的著名樹種，主要有檸檬桉、窿緣桉、直桿桉和藍桉等[1]。目前，廣東湛江是檸檬桉的主產(chǎn)區(qū)，現(xiàn)有桉林面積已達320余萬畝，年每畝可采鮮葉約1.0×104kg。藥理研究表明，檸檬桉葉主要含有揮發(fā)油萜類和黃酮類化合物[2]，有抗菌、抗炎、促進藥物透皮、清新空氣和殺蟲等功效[3]。植物總黃酮是一類具有抗氧化和清除自由基功能的活性物質(zhì)，由于其在抗衰老、治療心腦血管疾病和預(yù)防癌癥等方面有顯著功效，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療和保健行業(yè)，具有極大的開發(fā)和應(yīng)用前景[4-6]。目前，尚未見文獻報道檸檬桉葉黃酮類化合物提取工藝及其清除自由基活性的研究。為更好地發(fā)掘檸檬桉葉的保健功能，探索其活性功能因子，為檸檬桉葉更廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥食品和開發(fā)新型保健品提供參考，本研究中采用正交試驗法研究檸檬桉葉總黃酮的最佳提取工藝，繼而采用ABTS和DPPH自由基清除法，評價檸檬桉葉總黃酮的清除自由基化活性，為尋找高效、低毒的天然抗氧化劑奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

T9型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SB3200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DS型電熱三用水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；AY120型電子分析天平（日本島津公司）；DNM-9602G型酶標(biāo)儀（北京艾普在線科技有限公司）；DH-250型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 試藥

檸檬桉葉(筆者于當(dāng)?shù)刈圆?；DPPH試劑（2，2-二苯基苦味?；诫禄杂苫BTS試劑[2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽]，維生素C(VC)、維生素E(VE)、蘆丁、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝

稱取檸檬桉葉2份，每份50 g，分別放入蒸餾燒瓶中，加石油醚（60～90℃）約750 mL于蒸餾燒瓶中，脫脂3 h，共脫脂5次。棄石油醚，倒出，晾干，稱定質(zhì)量，即得已脫脂檸檬桉葉，備用。

稱取一定量脫脂檸檬桉葉，按本試驗最佳提取工藝條件，回流浸提，過濾，真空干燥，所得提取物用一定量溶劑溶解，定容，采用紫外分光光度法測定提取物中總黃酮的含量。

2.2 檸檬桉葉總黃酮含量測定方法

2.2.1 方法學(xué)考察

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取蘆丁9.95 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶，加水至刻度，超聲處理至全部溶解，得質(zhì)量濃度為0.398 0 g／L的溶液。精密吸取蘆丁對照品溶液0.40，0.80，1.30，1.60，2.00 mL，置加有200 mg鎂粉的25 mL具塞比色管中，各加50%的乙醇至3 mL，搖勻，將比色管置15℃的冰水浴中，緩慢滴加濃鹽酸2 mL并不斷振搖，蓋塞搖勻，加50%的乙醇至5 mL?？捎^察到對照品溶液變成紫紅色。在 500 nm波長下測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度(Y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.007 7 X-0.044 6(r＝0.999 9)。結(jié)果表明，蘆丁對照品質(zhì)量濃度在22.40～111.92 μg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密稱取檸檬桉葉，依法制備供試品溶液，取6份，依法進樣，測定吸光度。結(jié)果的 RSD為1.03%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液，于配制0，10，20，40，60 min后依法進樣，測定吸光度。結(jié)果的 RSD為2.02%（n＝5），表明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：稱取同一批檸檬桉葉6份，每份約10 g，精密稱定，同法制備供試品溶液，精密吸取2 mL，依法進樣，測定吸光度。結(jié)果的 RSD為0.30%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取同一批檸檬桉葉6份，每份約10 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，再精密加入蘆丁對照品適量，依法進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n＝6)

2.2.2 含量測定

取供試品溶液2.0 mL，其他步驟同標(biāo)準(zhǔn)溶液測定方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其質(zhì)量濃度，計算檸檬桉葉總黃酮平均含量為1.07%。

2.3 正交試驗優(yōu)化提取工藝

2.3.1 因素水平選擇

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、料液比（因素B）、提取時間（因素C）及提取次數(shù)（因素D）4個因素作 L9（34）正交試驗。因素水平表見表2。

總黃酮得率（%）＝[（VCD）／（1 000 w）]×100%

式中，V（mL）為試樣定容體積；C（g／L）為試樣中總黃酮的質(zhì)量濃度；D為稀釋倍數(shù)；w（g）為試樣質(zhì)量。

2.3.2 正交試驗設(shè)計

試驗方案見表 3。表 3中出現(xiàn)的 k1，k2，k3分別代表某個因素的不同水平的指標(biāo)值加和，K1，K2，K3分別代表某個因素的不同水平的指標(biāo)平均值，R代表極差。

2.3.3 結(jié)果分析

直觀分析和方差分析結(jié)果見表3和表4?？梢?，影響檸檬桉葉總黃酮提取的因素大小順序為D＞B＞C＞A，即提取次數(shù)為主要影響因素，料液比和提取時間為次要影響因素。對于因素A，K1＞K3＞K2，水平1為最優(yōu)，即乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為60%；對于因素B，K2＞K3＞K1，水平2為最優(yōu)，即最佳料液比為1∶15；對于因素C，K1＞K2＞K3，即最佳提取時間為1 h；對于因素D，K3＞K2＞K1，即最佳提取次數(shù)為3次。故確定檸檬桉葉總黃酮最佳提取工藝條件為A1B2C1D3，即60%的乙醇，料液比為1∶15，每次提取1 h，加熱回流提取3次。

表5 最佳提取工藝驗證試驗結(jié)果(n＝3)

2.3.4 最佳工藝驗證試驗

稱取3份檸檬桉葉50.0 g，精密稱定，按最佳工藝條件平行操作，得總黃酮的得率。由表5最佳工藝驗證結(jié)果表明，用最佳工藝條件提取，檸檬桉葉總黃酮得率(計算公式見后)均高于其他各正交試驗值，故本最佳工藝條件合理。同時，平均得率的 RSD＝1.84%(n＝3)，也表明此工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定性較好。

2.4 清除自由基活性研究

2.4.1 清除DPPH自由基活性測定[7-9]

準(zhǔn)確稱取供試品1 mg，加二甲基亞砜(DMSO)100 μL溶解，加無水乙醇900 μL稀釋，充分振蕩，配制成質(zhì)量濃度為1 g／L的供試品溶液。用乙醇依次稀釋成質(zhì)量濃度為1.000 000，0.500 000，0.250 000，0.125 000，0.062 500，0.031 250，0.015 625 g／L的溶液。陽性對照品（VC）溶液質(zhì)量濃度與上述供試品溶液相同。將100 μL不同質(zhì)量濃度的供試品溶液和100 μL DPPH乙醇溶液置 96孔板小孔內(nèi)，空白對照孔為100 μL乙醇和100 μL的DPPH乙醇溶液，重復(fù)3次，37℃遮光放置反應(yīng)30 min，測定其在517 nm波長處的吸光度。以VC作陽性對照，按下列公式計算樣品對DPPH自由基的清除率。

式中，Ac為加入DPPH試劑后的空白對照吸光度；Ai為加入DPPH試劑后的供試品溶液吸光度；Aj為未加入DPPH試劑時的供試品溶液吸光度。

圖1 檸檬桉葉總黃酮清除DPPH自由基作用

圖2 檸檬桉葉總黃酮清除ABTS自由基作用

結(jié)果見圖1。可見，檸檬桉葉總黃酮對自由基DPPH有清除作用，并在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)量效關(guān)系明顯。檸檬桉葉總黃酮與對照品VC清除DPPH自由基能力較接近，半數(shù)抑制量(IC50)值分別為 35.6 μg／mL和24.0 μg／mL。

2.4.2 清除ABTS自由基活性測定[10-11]

以VE為陽性對照，計算樣品對ABTS自由基的清除能力。每份樣品平行操作3次，取其平均值，按下列公式計算清除率。

式中，Ac為 ABTS自由基溶液的吸光度；Ac為ABTS溶液中加入樣品后的吸光度。

結(jié)果見圖2。可見，檸檬桉葉總黃酮對ABTS自由基具有較好的清除作用，并在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)量效關(guān)系明顯。檸檬桉葉總黃酮比對照品VE清除ABTS自由基的能力弱，IC50值分別為83 μg／mL和32 μg／mL。

3 討論

正交試驗結(jié)果表明，檸檬桉葉總黃酮提取的最佳工藝條件，料液比為1∶15（g／mL），提取溶劑為60%乙醇，每次提取1 h，提取3次。工藝驗證試驗表明，檸檬桉葉總黃酮得率均高于其他各正交試驗值，故本最佳工藝條件合理，且工藝重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好。

本研究結(jié)果顯示，檸檬桉葉總黃酮具有較強的清除DPPH自由基能力，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)量效關(guān)系明顯。總黃酮與對照品VC清除DPPH自由基能力較接近，IC50值分別為35.6 μg／mL和24.0 μg／mL。檸檬桉葉總黃酮具有一定的清除ABTS自由基能力，并在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)量效關(guān)系明顯?？傸S酮與對照品VE清除ABTS自由基的 IC50值分別為83 μg／mL和32 μg／mL。

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Extraction Techniques and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from the Leaves of Eucalyptus Citriodora

Lin Sanqing，Zhou Zhongliu，Yang Hongyan，Xia Jingmin，Yang Guizhen，Zhou Liangxia
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Lingnan Normal University，Zhanjiang，Guangdong，China 524048）

Objective To study the optimum extraction process of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora，and to test its scavenging free radical activity.M ethods The orthogonal experiment was used to investigate the effects of ethanol volume fraction，extraction times，ratio of material to liquid and extraction time on the process.The scavenging free radical activity test method was used to remove DPPH and ABTS free radicals as indicators，to evaluate the ability of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora to scavenge free radicals.Results The optimal extraction conditions of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora were as follows：60% alcohol as extraction solvent，extraction time 1 h，material to liquid ratio 1∶15，extraction 3 times.Under these conditions，the maximum extraction rate of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora was 0.312 7%.Conclusion The optimum extraction condition and purification experiment are very useful for further development of industrial process，which may be helpful for further development of Eucalyptus Citriodora as health protection foods.

Leaves of Eucalyptus Citriodora；total flavonoids；extraction；free radical

TQ46；R284.2；R282.71

A

1006-4931(2017)06-0005-04

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.002

國家級星火計劃項目[2015GA780041]；廣東高校青年創(chuàng)新人才項目；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目[YQ2015109]。

林三清（1983-），男，碩士研究生，實驗師，研究方向為天然產(chǎn)物活性成分分離分析，（電子信箱）muqing209＠163.com。

△通訊作者：周中流（1981-），男，博士研究生，副教授，研究方向為天然產(chǎn)物活性成分分離分析與藥物創(chuàng)新，（電子信箱）734911896＠qq.com。