李海霞，劉坤璐，李文斐，賈培媛，于衛(wèi)立，武軍華，胡濤，王玉霞，單俊杰，孫國輝

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；2.解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)航醫(yī)系，陜西西安710032；3.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100190；4.中國人民解放軍總醫(yī)院消化科，北京100853；5.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021）

茯苓多糖PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ作為疫苗佐劑的免疫原性

李海霞1，5，劉坤璐1，李文斐2，賈培媛3，于衛(wèi)立3，武軍華1，胡濤3，王玉霞1，單俊杰1，孫國輝4

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；2.解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)航醫(yī)系，陜西西安710032；3.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100190；4.中國人民解放軍總醫(yī)院消化科，北京100853；5.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021）

目的研究茯苓多糖（PCP）中PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ作為疫苗佐劑的免疫原性。方法①采用鑰孔戚血藍(lán)蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）為載體蛋白分別與PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ連接制備免疫抗原KLHPCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ及篩選抗原BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ。KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ分別與弗氏佐劑聯(lián)用id免疫家兔2次，ELISA檢測家兔血清中抗多糖抗體。②PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ單獨(dú)im免疫小鼠2次，ELISA檢測小鼠血清中抗多糖抗體。③PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ為佐劑分別配伍重組乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗（PRRSV）im或sc免疫小鼠2次，ELISA檢測小鼠血清中抗多糖抗體。結(jié)果①KLH-PCP-Ⅰ或KLH-PCP-Ⅱ與弗氏佐劑聯(lián)用免疫2次，可產(chǎn)生抗KLH和抗多糖抗體。②PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ單獨(dú)im免疫小鼠2次，檢測出低水平IgM抗體，未檢測出IgG抗體。③HBsAg或PRRSV抗原聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ免疫小鼠2次，未檢出抗多糖IgG抗體。結(jié)論P(yáng)CP-Ⅰ和PCP-Ⅱ本身免疫原性較弱，作為疫苗佐劑可能具有良好的安全性。

茯苓多糖；佐劑；抗體

茯苓（Poria）為非褶菌目多孔菌科茯苓屬真菌茯苓〔Poria cocos（Schw.）Wolf〕的干燥菌核。茯苓中的多糖成分具有顯著抗腫瘤、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用［1］。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖（Poria cocos polysaccharides，PCP）粗制品中2個多糖成分PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ?qū)1N1流感病毒滅活疫苗、乙肝疫苗抗原以及狂犬病病毒滅活疫苗均有顯著的疫苗佐劑活性，能顯著增強(qiáng)免疫動物體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)能力，提高染毒后的存活率［2-3］。PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ均由巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，PCP-Ⅰ的單糖摩爾比為巖藻糖︰甘露糖︰葡萄糖︰半乳糖=1.00︰1.81︰0.27︰7.27，PCP-Ⅱ的單糖摩爾比為巖藻糖︰甘露糖︰葡萄糖︰半乳糖=1.00︰1.63︰0.16︰6.29。PCP-Ⅰ的峰高相對分子質(zhì)量為3.0×105，PCP-Ⅱ的峰高相對分子質(zhì)量為2.9×105［2-3］。

本研究擬對PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的免疫原性進(jìn)行研究。首先將鑰孔戚血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）和牛血清白蛋白（bovine se?rum albumin，BSA）作為載體蛋白分別與PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ偶聯(lián)，制備免疫抗原KLH-PCP-Ⅰ和KLHPCP-Ⅱ及篩選抗原BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ。然后將免疫抗原聯(lián)用弗氏佐劑免疫家兔，同時也用PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ分別免疫小鼠。采用ELISA檢測血清抗原特異性抗體水平，評價多糖佐劑的免疫原性，為今后PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ體內(nèi)分布和代謝研究、作為疫苗佐劑開發(fā)的安全性評價提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，18～20 g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心，許可證編號SCXK-（軍）2012-0004；大耳白家兔，雌性，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，北京金牧陽實(shí)驗動物養(yǎng)殖有限公司，許可證編號SCXX（京）2015-0005。PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所天然藥物化學(xué)研究室制備。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（H+L）和N-四甲基聯(lián)苯胺購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；重組乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）由大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn)；豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗（porcine reproductive and respiratory syndrome virus inactivated vaccine，PRRSV）NVDC-JXA1株購自廣東永順生物制藥有限公司；KLH、BSA和抗小鼠亞類抗體購自Sigma公司；脫脂奶粉為伊利集團(tuán)產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific VARIOSKAN FLASH）；洗板機(jī)（美國Thermo Scientific WELL?WASH VERSA）。

1.2 KLH-PCP-Ⅰ，KLH-PCP-Ⅱ，BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ的制備

稱取2 mg PCP-Ⅰ，溶于20 mmol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.8）。然后加入高碘酸鈉將PCP-Ⅰ的鄰位羥基氧化成醛基，PCP-Ⅰ和高碘酸鈉的終濃度分別為2 g·L-1和20 mmol·L-1。室溫下避光反應(yīng)20 min后，加入適量的乙二醇終止反應(yīng)。用磷酸鹽緩沖液20 mmol·L-1（pH 7.4）對反應(yīng)液進(jìn)行透析，隨后加入KLH 2 mg和氰基硼氫化鈉1 mg，于4℃反應(yīng)過夜，得到多糖-蛋白偶聯(lián)物KLH-PCP-Ⅰ。偶聯(lián)物KLH-PCP-Ⅱ，BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ的制備方法與KLH-PCP-Ⅰ相同［4-5］。

1.3 KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ聯(lián)用弗氏佐劑免疫方案及抗體檢測

大耳白家兔6只，分為2組，每組3只，分別注射抗原KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ，每只300 μg。初次免疫配伍弗氏完全佐劑，免疫后28 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫；加強(qiáng)免疫配伍弗氏不完全佐劑。佐劑與抗原按1∶1比例（m/m）混合充分乳化，皮內(nèi)多點(diǎn)注射。分別在免疫后14 d耳緣靜脈取血，分離血清，酶聯(lián)反應(yīng)板分別包被KLH、BSA及檢測抗原BSA-PCP-Ⅰ或BSA-PCP-Ⅱ，每只家兔血清樣品采用ELISA檢測抗KLH和抗多糖抗體水平。

1.4 PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ單獨(dú)免疫方案及抗體檢測

BALB/c小鼠18只，分為3組，每組6只，分別im生理鹽水、PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ。PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的劑量為每只小鼠500 μg，生理鹽水為0.1 mL。初次免疫后28 d進(jìn)行同劑量加強(qiáng)免疫。分別在初次免疫和加強(qiáng)免疫后14 d剪尾采血，分離血清，采用ELISA測定抗多糖抗體水平。

1.5 HBsAg聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ的免疫方案

HBsAg分別與PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ聯(lián)用，分別采用sc和im 2種途徑免疫小鼠2次，間隔28 d。HBsAg免疫劑量為每只小鼠2 μg，PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的劑量均為每只小鼠200 μg，具體免疫方案見文獻(xiàn)［3］。分別采用BSA或BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ包被酶聯(lián)反應(yīng)板，檢測免疫小鼠血清中抗多糖抗體水平。

1.6 PPRSV聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ的免疫方案

BALB/c小鼠24只，分為4組，每組6只。分別sc生理鹽水、PRRSV、PRRSV+PCP-Ⅰ和PRRSV+ PCP-Ⅱ。PRRSV的劑量為每只小鼠10 μg，PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的劑量均為每只小鼠200 μg。初次免疫后28 d進(jìn)行同劑量加強(qiáng)免疫，分別在免疫后14 d剪尾采血，分離血清，采用ELISA測定抗多糖抗體水平。

1.7 ELISA法檢測血清抗多糖抗體滴度

家兔或小鼠血清用含0.1%吐溫-20的磷酸緩沖溶液（PBST，pH 7.4）等比稀釋。篩選抗原采用抗原包被液（碳酸鹽緩沖液0.05 mol·L-1，pH 9.6）稀釋至終濃度5 mg·L-1包被96孔板，每孔100 μL，4℃包被過夜。包被酶聯(lián)反應(yīng)板用PBST洗板3次，每孔加入250 μL 5%脫脂奶粉（PBS配制），37℃封閉1 h。后用PBST洗滌3次，加入稀釋的家兔或小鼠血清每孔100 μL，37℃孵育1 h。PBST洗滌3次，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（PBST 1∶1000稀釋），每孔100 μL，37℃孵育1 h。棄去二抗，PBST洗滌5次，再加入TMB底物顯色液，每孔100 μL，室溫避光顯色15 min。加入0.2 mol·L-1硫酸溶液每孔50 μL終止顯色，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度（A450nm）值。與正常對照動物比較，A450≥4倍時為抗體陽性。

2 結(jié)果

2.1 家兔血清中KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ特異性抗體水平

KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ作為免疫抗原，進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后14 d，ELISA檢測家兔血清中抗KLH和抗多糖的抗體水平（圖1）。結(jié)果表明，①以KLH包被酶聯(lián)反應(yīng)板，檢測出兔血清中產(chǎn)生高滴度水平的抗KLH抗體，滴度＞1∶200 000（圖1A1，B1）；②以BSA包被酶聯(lián)反應(yīng)板，未檢測出血清中含有抗BSA抗體（圖1A2，B2）；③以BSA-PCP-Ⅰ或BSA-PCP-Ⅱ包被酶聯(lián)反應(yīng)板，檢測發(fā)現(xiàn)血清中能產(chǎn)生較高滴度的抗PCP-Ⅰ或抗PCP-Ⅱ的多糖抗體，抗體滴度＞1∶25 000（圖1A3，B3）。

Fig.1 Serum antibody titers of rabbits immunized with keyhole limpet hemocyanin-Poria cocospolysaccharidesⅠ（KLH-PCP-Ⅰ）（A）and KLH-PCP-Ⅱ（B）plus Freund adjuvant at 14 d after second immunization detected by ELISA.Each rabbit received KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱid at the dose of 300 μg，and 28 d after the first immunization the booster 300 μg was given.The titer of each serum sample from immunized rabbits was measured respectively.A1 and B1：anti-KLH antibody；A2 and B2：anti-BSA antibody；A3：anti-PCP-Ⅰantibody；B3：anti-PCP-Ⅱantibody.x±s，n=3.

2.2 PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ單獨(dú)免疫小鼠血清中抗多糖抗體水平

小鼠分別im生理鹽水、PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ2次，兩次免疫間隔28 d，PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ免疫劑量為每只小鼠500 μg。采用ELISA測定初次和加強(qiáng)免疫IgG和IgM水平（圖2和圖3）。結(jié)果表明，①初次免疫后14 d，小鼠血清中均未檢測出抗PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的IgG抗體（圖2 A和B），也未檢測到相應(yīng)的IgM抗體（圖3）。②加強(qiáng)免疫后14 d，小鼠血清中抗PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的IgG抗體水平仍與生理鹽水組相同（圖2 C和D），而產(chǎn)生了抗PCP-Ⅰ的IgM抗體，抗PCP-Ⅱ的IgM水平無明顯變化（圖3）。表明PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ單獨(dú)免疫2次，可產(chǎn)生低水平的IgM，不能產(chǎn)生抗多糖的IgG抗體。

2.3 HBsAg聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ免疫小鼠血清中抗多糖抗體測定

Fig.2 Serum IgG antibody titers of mice immunized im with PCP-Ⅰand PCP-Ⅱalone twice detected by ELISA.Each mouse received im PCP-Ⅰor PCP-Ⅱ500 μg，and 28 d after the first immunization the booster 500 μg was im given.Anti-PCP-Ⅰand anti-PCP-ⅡIgG titers in serum of mice were detected at 14 d after the first immunization（A and B）and at 14 d after the second immu?nization（C and D）.x±s，n=6.

HBsAg（2 μg）聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ（200 μg），分別采用sc和im 2種途徑免疫小鼠2次，在第2次免疫后14 d檢測血清抗多糖抗體，采用BSA、BSAPCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ包被酶聯(lián)反應(yīng)板，結(jié)果（圖4）表明，①HBsAg聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱim免疫2次，血清中抗多糖IgG水平與單獨(dú)HBsAg和生理鹽水組IgG水平均相近（圖4 A和B）。②PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ作為佐劑與HBsAg聯(lián)用，sc免疫2次，小鼠血清中仍未檢測出抗多糖抗體（圖4 C和D）。提示PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ與HBsAg聯(lián)用im和sc免疫均不能產(chǎn)生抗PCP-Ⅰ和抗PCP-Ⅱ的多糖抗體。

2.4 PRRSV聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ免疫小鼠血清中抗多糖抗體測定

PRRSV（10 μg）聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ（200 μg）免疫小鼠2次，分別采用KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ包被，ELISA法檢測免疫小鼠血清中抗多糖抗體（圖5）。結(jié)果表明，PRRSV聯(lián)用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ多糖佐劑，血清中抗多糖抗體水平與生理鹽水組和單獨(dú)PRRSV組均相近，提示PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ作為佐劑與PRRSV疫苗聯(lián)用，不能產(chǎn)生抗多糖抗體。

Fig.3 Serum IgM antibody titers of mice immunized im with PCP-Ⅰ（A）and PCP-Ⅱ（B）alone twice detected by ELISA.See Fig.2 for the mouse treatment.x±s，n=6.

Fig.5 Serum PCP IgG antibody titers of mice immu?nized with porcine reproductive and respiratory syn?drome virus inactivated vaccine（PRRSV）plus PCP-Ⅰ（A）and PCP-Ⅱ（B）by sc injections at 14 d after second vaccine.Each mouse received sc PRRSV 10 μg plus PCP-Ⅰor PCP-Ⅱ500 μg，and 28 d after the first immunization the booster was given.x±s，n=6.

Fig.4 Serum PCP IgG antibody titers of mice immunized with HBsAg plus PCP-Ⅰor PCP-Ⅱby im（A，B）or sc（C，D）injections at 14 d after second vaccine.Each mouse was immunized twice at an interval of 28 d with HBsAg 2 μg plus PCP-Ⅰ200 μg or PCP-Ⅱ200 μg.x±s，n=6.

3 討論

多糖具有多種生物活性，與維持生物功能密切相關(guān)。多糖可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，它不僅能激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成活化補(bǔ)體，從而在抗腫瘤、抗病毒以及抗衰老等方面具有獨(dú)特的功效。多糖注射液也進(jìn)入臨床應(yīng)用，如人參多糖和香菇多糖注射液聯(lián)合化療用于治療晚期胃癌，可減輕晚期胃癌患者化療所致不良反應(yīng)，提高患者細(xì)胞免疫功能，改善患者生活質(zhì)量［6-7］。

細(xì)菌中也存在多種多糖類物質(zhì)，它們在細(xì)菌的識別、信號傳遞、黏附、感染及防御等方面發(fā)揮著重要作用，其中與致病性相關(guān)的包括莢膜多糖及脂多糖中的O抗原多糖等。莢膜多糖和O抗原多糖具有免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。這些多糖均屬于T細(xì)胞非依賴抗原，進(jìn)入機(jī)體后，通過與B細(xì)胞表面的抗原識別受體交聯(lián)而激活B細(xì)胞，使B細(xì)胞分化為可分泌抗體的漿細(xì)胞。在整個免疫過程中并無T細(xì)胞參與，因此不會形成免疫記憶，產(chǎn)生的抗體主要是親和力較低的IgM和IgG2［8-9］。由于莢膜多糖屬于T細(xì)胞非依賴性抗原，對≤2歲兒童的免疫效果不佳，且不能誘導(dǎo)免疫記憶應(yīng)答。目前解決的辦法是將多糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上成為結(jié)合疫苗，使其轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞依賴性抗原，以誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫保護(hù)效果。如傷寒Vi抗原與載體蛋白破傷風(fēng)類毒素等結(jié)合轉(zhuǎn)換成T細(xì)胞依賴性抗原，則可誘導(dǎo)較強(qiáng)的應(yīng)答［10］。

近年來國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，多種天然多糖具有良好的疫苗佐劑的活性，通過與滅活疫苗或蛋白亞單位抗原合用，能明顯增強(qiáng)疫苗的免疫效果，促進(jìn)機(jī)體特異性或非特異性免疫、細(xì)胞免疫與體液免疫，而多糖自身具有天然、低毒和無藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)，已成為疫苗佐劑研究的一個熱點(diǎn)［11］。國外已將落葉松中阿拉伯半乳聚糖作為肺炎疫苗佐劑用于臨床Ⅱ期試驗，殼聚糖用于HIV疫苗也在臨床試驗中，均表明能有效提高疫苗的免疫反應(yīng)，而未顯示明顯的不良反應(yīng)［12-13］。

已有文獻(xiàn)報道，PCP粗制品對禽皰疹病毒1型（又稱馬雷克病病毒，Gallid herpesvirus 1，Marus disease virus）活毒株及流感病毒滅活疫苗有較好的佐劑活性，能提高免疫動物的體液免疫功能［14-15］，但未對其活性多糖成分進(jìn)行深入研究。本課題組采用OVA抗原也證實(shí)，PCP粗制品具有良好的佐劑活性［16］。繼而采用H1N1流感滅活疫苗和HBsAg對PCP粗制品中活性多糖成分進(jìn)行追蹤和評價，發(fā)現(xiàn)了PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ2個活性多糖佐劑。目前已評價了它們對炭疽PV抗原、狂犬病病毒滅活疫苗、PRRSV滅活疫苗和豬口蹄疫O型病毒滅活疫苗的作用，均顯示具有良好的佐劑活性，其效果優(yōu)于鋁佐劑。此外，本課題組將其按每只小鼠500 μg劑量肌內(nèi)連續(xù)免疫小鼠3次，每次間隔28 d，尚未發(fā)現(xiàn)PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ?qū)π∈笱荷笜?biāo)、肝功能和腎功能有不良反應(yīng)（待發(fā)表）。

由于PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的相對分子質(zhì)量均＞5000，因此觀察其作為疫苗佐劑本身是否具有免疫原性。本研究發(fā)現(xiàn)，它們與KLH化學(xué)偶聯(lián)免疫家兔可產(chǎn)生高滴度抗原特異性抗體，多糖單獨(dú)免疫小鼠2次，僅產(chǎn)生低水平IgM抗體。PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ作為疫苗佐劑與HBsAg和PRRSV滅活疫苗聯(lián)用免疫小鼠，小鼠血清中能檢測出高滴度抗原特異性抗體，而未檢出多糖特異性IgG抗體。提示PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ本身免疫原性弱，安全性良好。本研究為PCP的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了有力的安全依據(jù)。

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Immunogenicity of Poria cocos polysaccharides PCP-Ⅰand PCP-Ⅱas vaccine adjuvants

LI Hai-xia1,5,LIU Kun-lu1,LI Wen-fei2,JIA Pei-yuan3,YU Wei-li3,WU Jun-hua1,HU Tao3, WANG Yu-xia1,SHAN Jun-jie1,SUN Guo-hui4
(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 2.School of Aerospace Medicine,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China; 3.Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China; 4.Department of Gastroenterology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853,China; 5.School of Pharmaceutical,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

OBJECTIVETo investigate the immunogenicities of Poria cocos polysaccharides, PCP-Ⅰand PCP-Ⅱ,as a vaccine adjuvant.METHODS①Keyhole limpet hemocyanin(KLH)was linked to PCP-Ⅰor PCP-Ⅱrespectively to prepare immuno-antigen KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱ.Bovine serum albumin(BSA)was also linked to PCP-Ⅰor PCP-Ⅱrespectively to prepare screening-antigen. Rabbits were immunized with KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱplus Freund adjuvant by intradermal injection twice,and serum specific antibody titers were determined by ELISA.②BALB/c mice were immunized with PCP-Ⅰor PCP-Ⅱalone intramuscularly twice,and serum polysaccharide antibody titers were determined by ELISA.③BALB/c mice were co-immunized intramuscularly or subcutaneously with PCP-Ⅰor PCP-Ⅱplus hepatitis B surface antigen(HBsAg)or porcine reproductive and respiratory syndrome virus inactivated vaccine(PRRSV)twice,and serum polysaccharide-antibody titers were determined by ELISA.RESULTS①Serum anti-KLH and anti-polysaccharides(PCP-Ⅰor PCP-Ⅱ)antibodies were pro?duced after rabbits were immunized with KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱplus Freund adjuvant twice.②Serum anti-PCP-Ⅰor anti-PCP-Ⅱantibodies were not found after mice were immunized with PCP-Ⅰand PCP-Ⅱalone twice.③After mice were immunized with HBsAg or PRRSV plus PCP-Ⅰor PCP-Ⅱtwice,serum anti-PCP-Ⅰor anti-PCP-Ⅱantibodies were not found.CONCLUSIONPCP-Ⅰand PCP-Ⅱshow weak immunogenicity,which may be quite safe as a vaccine adjuvant.

Poria cocos polysaccharides;adjuvant;antibody

WANG Yu-xia,E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com,Tel:(010)66931645;SHAN Jun-jie, E-mail:shanjunjie001@126.com,Tel:(010)66930644;SUN Guo-hui,E-mail:sungh301xhk@163.com,Tel:(010)55499206

R967

：A

：1000-3002-（2017）03-0255-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.009

2016-08-05接受日期：2017-03-05）

（本文編輯：齊春會）

李海霞，女，碩士研究生，主要從事多糖免疫活性研究，E-mail：lihaixiayes@163.com

王玉霞，E-mail：wangyuxia1962@hotmail.com，Tel：（010）66931645；單俊杰，E-mail：shanjunjie001@126. com，Tel：（010）66930644；孫國輝，E-mail：sungh301xhk@ 163.com，Tel：（010）55499206