夏 雨， 周景文， 陳 堅*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

吡咯喹啉醌高通量檢測方法的建立與優(yōu)化

夏 雨1，2， 周景文1，2， 陳 堅*1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一種新型輔酶，具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)PQQ檢測方法在檢測發(fā)酵液中PQQ濃度時都存在一定的缺陷，且檢測效率偏低。本研究在大腸桿菌（Escherichia coli BL21（DE3））中表達(dá)E.coli K-12來源的葡萄糖脫氫酶（PQQGDH），并通過親和層析分離純化PQQGDH，得到了高濃度、高純度的PQQGDH。通過酶液和PQQ樣品用量的雙因素正交實驗對傳統(tǒng)重組酶法的反應(yīng)體系加以改進(jìn)，得到適用于96孔板高通量檢測的反應(yīng)體系。結(jié)果表明30 μL純化后酶液、2 μL PQQ樣品配合1.2 mL的顯色劑組成的顯色體系檢測效果最佳。該方法線性范圍大且具有較高的精確度和重現(xiàn)性。本研究中利用高濃度、高純度的PQQGDH配合96孔板和酶標(biāo)儀，所建立的PQQ高通量檢測方法，不僅降低了實驗誤差，而且大幅提高了PQQ發(fā)酵液樣品的檢測效率。

吡咯喹啉醌；葡萄糖脫氫酶；親和純化；重組酶法檢測；高通量檢測

Keywords：pyrroloquinoline quinone，D-glucose dehydrogenase，affinity purification，enzymatic measurement，high-throughput measurement

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一種有別于吡啶核苷酸 （NAD、NADP）和核黃素（FMN、FAD）的第三類輔酶，廣泛存在于革蘭氏陰性菌中[1]。PQQ是大量膜結(jié)合脫氫酶的輔酶，例如普通生酮基古龍酸菌（Ketogulonicigenium vulgare）中的L-山梨糖脫氫酶與L-山梨酮脫氫酶、氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）中的D-山梨醇脫氫酶和大腸桿菌（Escherichia coli）中的葡萄糖脫氫酶（PQQGDH）等都以PQQ為輔酶[2-3]。PQQ不僅是一種輔酶，它還具有許多生物活性，應(yīng)用前景廣闊。例如抗氧化及加速某些動植物生長等[4-5]。此外，實驗表明PQQ可以通過氧化還原反應(yīng)激活表皮生長因子受體，從而起到促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的作用[6]。人體實驗表明，服用PQQ后人體內(nèi)一些線粒體代謝相關(guān)的指標(biāo)會發(fā)生明顯改變[7]。PQQ應(yīng)用前景廣闊，但發(fā)酵液中PQQ濃度的檢測方法還不完善。

PQQ傳統(tǒng)的定量檢測方法包括高效液相色譜法、非酶法（NBT-Gly法）、紫外吸收光譜法以及重組酶法，各個方法適用范圍不同且各有優(yōu)缺點。高效液相色譜法專一性強、可重復(fù)性強；但衍生化操作復(fù)雜，尤其是發(fā)酵液需要處理后才能經(jīng)HPLC檢測PQQ，且對PQQ的純度要求很高、靈敏度低[8]。NBT-Gly法操作快速簡便、適用于大量檢測樣品；但硝基四唑蘭（NBT）暴露在空氣中很快即被氧化，所以此方法準(zhǔn)確度不高且重復(fù)性也不佳[9]。紫外吸收光譜法無需要復(fù)雜的試劑和昂貴儀器；但如果培養(yǎng)基顏色較深就會影響吸光值測定的準(zhǔn)確度[10]。重組酶法是所有方法中靈敏度最高的，且專一性強；但該方法中所用脫輔酶的葡萄糖脫氫酶（PQQGDH）來自野生菌膜組分，膜組分制備操作復(fù)雜，且得到膜組分中PQQGDH純度和濃度都很低，一次實驗?zāi)軝z測樣品數(shù)較少[11-12]。

綜合以上PQQ檢測方法的優(yōu)缺點，發(fā)現(xiàn)重組酶法靈敏度、高專一性強且受干擾因素最少，最適于發(fā)酵液中PQQ濃度的測定。傳統(tǒng)重組酶法所用酶液中PQQGDH濃度和純度較低，且膜組分制備復(fù)雜，不利于PQQ樣品的大量檢測，因此制備高純度的PQQGDH是改進(jìn)該方法關(guān)鍵。本研究中高效表達(dá)了PQQGDH，并分離純化得到了高濃度、高純度的PQQGDH。利用高濃度、高純度的PQQGDH優(yōu)化了重組酶法反應(yīng)體系，引入96孔板和酶標(biāo)儀，建立了PQQ高通量檢測方法，不僅降低了實驗誤差而且能高通量對發(fā)酵液樣品進(jìn)行檢測，大幅提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 G.oxydans WSH-003，購自江蘇江山制藥有限公司；用于載體構(gòu)建的 E.coli JM109，用于擴增葡萄糖脫氫酶序列的E.coli K-12，用于表達(dá)葡萄糖脫氫酶的E.coli BL21（DE3）以及表達(dá)載體pET-28a，購自Novagen公司。用于載體構(gòu)建的pMD19-T Simple，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L；TB培養(yǎng)基：蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mg/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L；山梨醇培養(yǎng)基：山梨醇150 g/L，酵母粉10 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇150 g/L，酵母浸膏20 g/L。固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂。

2）E.coli JM109培養(yǎng)條件：從LB固體平板上劃線得到E.coli JM109單菌落，挑取單菌落于加有25 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，放置于37℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)。

3）E.coli BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)條件：從甘油管取100 μL E.coli BL21（DE3）接種于25 mL LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)；取5 mL轉(zhuǎn)接于500 mL TB培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)4 h至OD為1.0；加異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終摩爾濃度400 μmol/L，25℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。

4）G.oxydans培養(yǎng)條件：從山梨醇固體平板上劃線得到G.oxydans單菌落，挑取單菌落接種至加有25 mL山梨醇培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，放置于30℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)36 h，按體積分?jǐn)?shù)10%接種量轉(zhuǎn)接至加有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL的搖瓶中，放置于30℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)48 h。

培養(yǎng)過程中抗生素用量為卡那霉素50 μg/mL或氨芐青霉素100 μg/mL。

1.1.3 主要試劑和儀器 E.coli JM109高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；用于DNA片段的回收和純化的GeneJET Gel Extraction Kit，購自Thermo公司；限制性內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶，2，6-二氯靛酚（DCIP）和硫酸甲酯吩嗪（PMS）等，購買自寶生物工程（大連）有限公司；PQQ標(biāo)準(zhǔn)品，購自sigma公司；Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler型PCR儀，Gene Pulser XcellTM型Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀，美國伯樂公司 （BIO-BAD）產(chǎn)品；Thermo Multiskan FC型酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a-gcd表達(dá)載體的構(gòu)建 提取E.coli K-12的基因組，用gcd-F和gcd-R引物PCR擴增葡萄糖脫氫酶基因gcd（見表1）。將gcd基因連接pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化E.coli JM109并涂布含卡那霉素的LB平板，菌落PCR并挑選正確的轉(zhuǎn)化子送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。提取測序正確轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切提取的質(zhì)粒得到正確的gcd基因片段，同時用BamHI和Hind III雙酶切pET-28a表達(dá)載體。將酶切后的gcd基因與pET-28a載體按體積比4∶1進(jìn)行連接，得到pET-28a-gcd，并轉(zhuǎn)化預(yù)先制備的E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，得到E.coli BL21（DE3）/pET-28a-gcd重組菌株。

1.2.2 PQQGDH的誘導(dǎo)表達(dá) 從LB平板挑取E.coli BL21（DE3）/pET-28a-gcd單菌落接種于25 mL LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。取5 mL轉(zhuǎn)接于500 mL TB培養(yǎng)基，30℃、220 r/min培養(yǎng) 4 h至OD600為1.0，加IPTG至終濃度400 μmol/L，25℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至離心杯，4 000 r/min離心10 min，棄上清液。加50 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸菌體，超聲波破碎20 min，破碎液10 000 r/min離心30 min，棄上清液。加50 mmol/L PBS溶液（pH 7.0）重懸沉淀，得到PQQGDH的粗酶液。E．coli BL21（DE3）/pET-28agcd誘導(dǎo)表達(dá)后的全細(xì)胞液，E．coli BL21（DE3）/ pET-28a-gcd未經(jīng)誘導(dǎo)的全細(xì)胞液，E．coli BL21（DE3）/pET-28a-gcd菌誘導(dǎo)表達(dá)后的破碎上清液分別加上樣緩沖液并煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE分析。用 NuPAGE○R預(yù)制凝膠系統(tǒng)（Life Technologies公司）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電壓200 V，電流100 mA，MOPS緩沖液 （母液為20× MOPS緩沖液），上樣量為10 μL。電泳完畢后，用考馬斯亮藍(lán)染色2 h后脫色。

1.2.3 PQQGDH的分離純化 利用AKTA純化系統(tǒng)與Ni-NTA親和層析柱（QIAGEN）提純葡萄糖脫氫酶[13]。將純化后的PQQGDH按進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。蛋白質(zhì)濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）[14]，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.2.4 PQQ高通量檢測反應(yīng)體系的確定 將0.005 8 g DCIP、0.061 2 g PMS、0.36 g葡萄糖和 0.004 8 g MgSO4溶解于100 mL 50 mmol/L的PBS溶液（pH 7.0）中，制成酶活檢測所需顯色劑。分別取四組5、10、30 μL和50 μL純化后酶液于96深孔板中，每組分別加入2、20、50 μL和100 μL發(fā)酵48 h后的G.oxydans WSH-003（PQQ生產(chǎn)菌）發(fā)酵液上清液，于30℃溫育10 min。然后往每個孔中加入1.2 mL制好的顯色劑，混勻后吸取200 μL加入96孔板，立即放入酶標(biāo)儀，在OD620濾鏡下每20 s檢測一次反應(yīng)液褪色情況，檢測10 min。確定最佳的酶液和PQQ樣品用量。

1.2.5 PQQ標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 根據(jù)1.2.4實驗確定的酶液和PQQ樣品用量，將酶液和不同質(zhì)量濃度的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品加入96深孔板，于30℃溫育10 min后，加入1.2 mL制好的顯色劑，混勻后吸取200 μL加入96孔板，立即放入酶標(biāo)儀，在OD620濾鏡下每20 s檢測一次反應(yīng)液褪色情況，檢測10 min。計算DCIP褪色速率，根據(jù)標(biāo)樣的PQQ質(zhì)量濃度和DCIP褪色速率的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定G.oxydans胞外的PQQ質(zhì)量濃度。

檢測細(xì)胞胞內(nèi)PQQ質(zhì)量濃度時，取1 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心1 min，棄上清液并加等體積的50 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.0）重懸菌體，超聲波破碎5 min。破碎液于12 000 r/min離心2 min，棄上清液，加入1 mL 50 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.0）得到G.oxydans的胞內(nèi)破碎液，用于檢測G.oxydans胞內(nèi)的PQQ質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PQQGDH的誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

將測序驗證正確的重組質(zhì)粒pET-28a-gcd轉(zhuǎn)化進(jìn)入 E.coli BL21得到重組菌并誘導(dǎo)表達(dá)PQQGDH。E.coli BL21（DE3）所表達(dá)PQQGDH為胞漿蛋白。如圖1所示，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，對照菌株在87×103處未見明顯條帶 （泳道2），而重組菌株在87×103處有明顯蛋白質(zhì)條帶 （泳道 1）， 表明PQQGDH得到了高效表達(dá)。隨后破碎重組菌株的細(xì)胞，利用AKTA純化系統(tǒng)與Ni-NTA親和層析柱（QIAGEN）提純，如泳道4所示，得到較高純度PQQGDH蛋白質(zhì)，并用此蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定，純化后酶液的蛋白質(zhì)濃度為266.4 mg/L。

圖1 葡萄糖脫氫酶表達(dá)后SDS-PAGE電泳檢測Fig.1 SDS-PAGE analysis of PQQGDH from E.coli BL21（DE3）

2.2 高通量檢測體系的建立

為了建立最佳檢測發(fā)酵液中PQQ質(zhì)量濃度的高通量檢測體系，本實驗中選用G.oxydans發(fā)酵液上清液作為PQQ樣品進(jìn)行顯示反應(yīng)，更真實地模擬實際檢測條件。為了確定反應(yīng)體系中酶液和PQQ樣品的最佳用量，分別以5、10、30 μL和50 μL酶液（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度266.4 mg/L）用量條件與2、20、50 μL和100 μL PQQ樣品 （G.oxydans發(fā)酵液上清液）用量條件設(shè)計正交實驗。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，所有用5 μL和10 μL酶液進(jìn)行的顯色反應(yīng)，DCIP褪色不明顯，不利于DCIP褪色速率的計算；所有用100 μL發(fā)酵液上清液進(jìn)行的顯色反應(yīng)，加入顯色劑后體系褪色極快，無法計算DCIP的褪色速率。

在用50 μL酶液進(jìn)行顯色反應(yīng)中，用50 μL發(fā)酵液上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)時，DCIP在40 s褪色變緩，只得到3個時間點的有效OD值數(shù)據(jù)，不利于DCIP褪色速率的準(zhǔn)確計算；用20 μL發(fā)酵上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)時，DCIP在80 s褪色結(jié)束，得到的有效數(shù)據(jù)也較少。用2 μL發(fā)酵上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)時，DCIP在6 min后不再褪色，可以得到較多時間點的數(shù)據(jù)，且DCIP吸光度與時間呈很好的線性關(guān)系（見圖2（a））。在用30 μL酶液進(jìn)行顯色反應(yīng)中，用50 μL發(fā)酵上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)時，DCIP在60 s后不再褪色，無法得到足夠的點計算DCIP褪色速率；用20 μL發(fā)酵上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)時，DCIP在100 s后褪色結(jié)束，數(shù)據(jù)較少不利于DCIP褪色速率的準(zhǔn)確計算。在用2 μL發(fā)酵上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)時，DCIP在8 min后不再褪色，可以得到較多時間點的OD數(shù)據(jù)，且DCIP吸光度與時間呈很好的線性關(guān)系（見圖2（b））。

圖2 不同PQQ樣品用量對DCIP褪色速率的影響Fig.2 Effect of different volumes of PQQ on the fading rate of DCIP

以上結(jié)果表明，PQQ樣品用量為2 μL、酶液用量30 μL或50 μL時，可以得到較好的吸光值隨時間變化數(shù)據(jù)，有利于準(zhǔn)確計算DCIP褪色速率，從而更準(zhǔn)確地測定PQQ質(zhì)量濃度。最終選擇30 μL酶液、2 μL PQQ樣品用量的反應(yīng)體系。根據(jù)酶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度可知30 μL酶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量為7.99 μg。500 mL TB培養(yǎng)基發(fā)酵工程菌可以得到50 mL酶液（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度266.4 mg/L），每個反應(yīng)體系僅需30 μL純化后的酶液，一次純化得到的PQQGDH可用于1 600多個樣品的檢測。

2.3 PQQ標(biāo)準(zhǔn)曲線及G.oxydans胞內(nèi)外PQQ質(zhì)量濃度的測定

為了測定G.oxydans胞內(nèi)外PQQ質(zhì)量濃度，首先制作PQQ標(biāo)準(zhǔn)曲線。將30 μL酶液和2 μL PQQ標(biāo)樣（20、40、60、80 μg/L和100 μg/L）于30℃溫育10 min后，加入1.2 mL制好的顯色劑，混勻后吸取200 μL加入96孔板，立即放入酶標(biāo)儀，在OD620濾鏡下每20 s檢測一次反應(yīng)液褪色情況，檢測10 min。計算不同質(zhì)量濃度PQQ標(biāo)樣的DCIP褪色速率，根據(jù)PQQ質(zhì)量濃度和DCIP褪色速率的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到重復(fù)性較高的PQQ質(zhì)量濃度和DCIP褪色速率的線性方程 （y=6.11×10-5x+8.34×10-5，R2=0.998 1）（見圖3）。

圖3 PQQ檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～100 μg/L）Fig.3 Standard curve for determination of PQQ（0～100 μg/L）

為驗證本方法測定發(fā)酵液中PQQ質(zhì)量濃度的可靠性，選取G.oxydans作為研究對象，測定其胞內(nèi)外PQQ質(zhì)量濃度。將G.oxydans WSH-003按1.1.2所示方法培養(yǎng)，測定G.oxydans胞外PQQ濃度為（48.8±2.4）μg/L；將細(xì)胞破碎后用PBS緩沖液重懸，測定G.oxydans胞內(nèi)PQQ質(zhì)量濃度為（8.1±1.3）μg/L。與文獻(xiàn)報道的G.oxydans胞外PQQ質(zhì)量濃度（44.6±7.9）μg/L，胞內(nèi)濃度是胞外的20%相吻合[15]。

2.4 PQQ高通量檢測法精確度、重現(xiàn)性和線性范圍的測定

分別配制6個濃度為100 μg/L的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品，測定DCIP褪色速率分別為0.006 11、0.006 23、0.006 31、0.006 09、0.006 18 s-1和0.006 28 s-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.44%。測定同一搖瓶內(nèi)G.oxydans發(fā)酵上清液6次，所得PQQ質(zhì)量濃度分別為42.3、43.3、44.2、42.6、42.1 μg/L和43.3 μg/L，RSD為1.82%。這表明利用表達(dá)純化后的PQQGDH建立的PQQ高通量檢測方法有較高的精確度和重現(xiàn)性。圖3所做標(biāo)準(zhǔn)曲線測量范圍較?。?～100 μg/L），為了確定該檢測方法的線性范圍，進(jìn)一步選取 0、100、500、1 000、1 500、2 000、3 000 μg/L和 5 000 μg/L的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。PQQ質(zhì)量濃度在0～2 000 μg/L范圍內(nèi)，PQQ質(zhì)量濃度與DCIP褪色速率表呈線性關(guān)系 （y=6.31×10-5x-3.01×10-4，R2=0.997 4）（見圖4）。在用3 000 μg/L和5 000 μg/L的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重組酶法檢測時，DCIP褪色過快，無法準(zhǔn)確測定DCIP褪色速率。因此，用文中所配制顯色劑檢測PQQ的線性范圍為0～2 000 μg/L。如需測定PQQ質(zhì)量濃度高于2 000 μg/L的樣品，應(yīng)增加顯色劑中DCIP和PMS的用量，以便準(zhǔn)確測定DCIP褪色速率。

圖4 PQQ檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～2 000 μg/L）Fig.4 Standard curve for determination of PQQ（0～2 000 μg/L）

3 結(jié)語

本研究中通過誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化，得到了高濃度、高純度的PQQGDH，建立了PQQ高通量檢測方法，降低實驗誤差的同時大幅提高了PQQ發(fā)酵液樣品的檢測效率。建立并優(yōu)化后的PQQ高通量檢測法具有3大優(yōu)勢。首先，傳統(tǒng)重組酶法的PQQGDH需要通過多次破碎和超速離心得到，野生菌中PQQGDH含量很低，而重組酶法又需要大量的PQQGDH，一次檢測蛋白用量為1 mg/mL[16]。利用重組菌發(fā)酵一次可以制備更多更純的PQQGDH，500 mL TB培養(yǎng)基發(fā)酵工程菌得到的PQQGDH可用于1 600多個樣品的檢測。且純化后的PQQGDH可于-20℃長期保存，無需每次檢測前臨時制備酶液。其次，傳統(tǒng)重組酶法提到要用乙二胺四乙酸（EDTA）多次沖洗膜組分才能去除膜組分中PQQGDH活性的背景干擾[17]。純化后的PQQGDH無需EDTA處理，純化后酶液中雜蛋白質(zhì)少，不會對顯色體系造成干擾。最后，通過正交實驗確定了PQQ高通量檢測反應(yīng)體系為 30 μL酶液、2 μL PQQ標(biāo)準(zhǔn)品或樣品以及1.2 mL顯色劑，縮小了反應(yīng)體系，配合96孔板和酶標(biāo)儀實現(xiàn)了PQQ高通量檢測，在得到更準(zhǔn)確的DCIP褪色速率的同時大幅提高了PQQ檢測效率。該方法線性范圍大且具有較高的精確度和重現(xiàn)性。由此可見，利用成熟的生物技術(shù)和先進(jìn)的科研儀器建立并優(yōu)化后的PQQ高通量檢測方法可以更加精確而高效地檢測PQQ。

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Establishment and Optimization of the High-Throughput Measurement of Pyrroloquinoline Quinone

XIA Yu1，2， ZHOU Jingwen1，2， CHEN Jian*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Pyrroloquinoline quinone（PQQ）is a new coenzyme that has broad application prospect. Previous methods used for measuring PQQ in fermentation broth are defective and low-efficient.In this study，D-glucose dehydrogenase（PQQGDH）from Escherichia coli K-12 was expressed in E.coliBL21 and then purified by the nickel-affinity chromatography column.For the high-throughput measurement of PQQ the optimal reaction system was found by orthogonal experiment to contain 30 μL PQQGDH，2 μL PQQ sample and 1.2 mL chromogenic reagent.The method was linear within a wide range and had high precision and good reproducibility.Compared with traditional methods，the high-throughput measurement of PQQ using purified PQQGDH，96-well plate and microplate reader are herein more accurate and efficient.

Q 814

A

1673—1689（2017）02—0122—07

2015-03-22

國家863計劃項目（2012AA022103）。

*通信作者：陳 堅（1965—），男，江蘇揚州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，國家杰出青年基金獲得者，主要從食品生物技術(shù)及生化工程研究。E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn

夏雨，周景文，陳堅.吡咯喹啉醌高通量檢測方法的建立與優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（02）：122-128.