劉賢稱,張青,馮佳,靳欽,張曙

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

結(jié)直腸癌患者癌組織中SPY1蛋白表達(dá)變化及意義

劉賢稱,張青,馮佳,靳欽,張曙

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

目的 觀察SPY1蛋白在結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)變化并探討其意義。方法 收集169例結(jié)直腸癌石蠟包埋標(biāo)本，運(yùn)用Western blotting及免疫組化Envision法檢測SPY1蛋白表達(dá)情況，結(jié)合臨床病理特征和隨訪資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 SPY1蛋白陽性表達(dá)于結(jié)直腸癌組織的細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色點(diǎn)狀，低或無表達(dá)84例(49.70%)，高表達(dá)85例(50.30%)。SPY1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與TNM分期、腫瘤浸潤深度及術(shù)前血清癌胚抗原(CEA)值有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。Kaplan-Meier生存曲線顯示SPY1高表達(dá)者比低表達(dá)者5年生存率低。Log-Rank檢驗(yàn)行單因素生存分析顯示SPY1表達(dá)程度、腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)前血CEA值與術(shù)后生存時(shí)間有關(guān)(P均<0.05)，而患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤組織學(xué)類型與術(shù)后生存無關(guān)(P均>0.05)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析顯示SPY1表達(dá)程度、腫瘤分化程度、TNM分期及術(shù)前血CEA值為預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)。結(jié)論 SPY1蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，其與患者TNM分期、腫瘤浸潤深度及術(shù)前血CEA值密切相關(guān)，檢測其水平有助于患者預(yù)后判斷。

結(jié)直腸癌；SPY1蛋白；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌(CRC)是全球常見的惡性腫瘤之一，約有近25%的CRC患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，尤其是新的靶向藥物引進(jìn)，CRC患者5年生存率有所上升，但總存活率仍不樂觀[2，3]。因此，有必要探索更多CRC特定的預(yù)后靶點(diǎn)來對(duì)患者進(jìn)行評(píng)估，為進(jìn)一步的靶向治療提供理論依據(jù)。人類Speedy A1(SPY1)是Speedy/RINGO家族中的一員，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (CDKs)的活化分子，可活化CDK2促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。目前，國內(nèi)尚無關(guān)于SPY1表達(dá)與CRC預(yù)后關(guān)系的研究。2009年1月～2010年12月，我們通過檢測SPY1蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與CRC各臨床病理特征及預(yù)后間的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2009～2010年169例CRC患者癌組織石蠟標(biāo)本及其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離癌組織5 cm)標(biāo)本。其中男108例、女61例，年齡45～75歲，平均60歲。結(jié)腸癌124例，直腸癌45例；組織學(xué)類型包括管狀腺癌和乳頭狀腺癌151例，混合型(管狀和黏液)腺癌6例，黏液腺癌8例，印戒細(xì)胞癌2例，腺鱗癌2例；組織分化程度：低分化15例，高、中分化154例；根據(jù)AJCC第7版結(jié)腸直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：0～Ⅰ期31例，Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期72例。所有標(biāo)本患者術(shù)前未經(jīng)任何放化療或免疫治療。所有病例有相應(yīng)的臨床資料及隨訪記錄，隨訪率100%，隨訪截至2015年6月，最長生存時(shí)間為62個(gè)月，最短為3個(gè)月。

1.2 SPY1蛋白表達(dá)測定 CRC腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)脫蠟水化，微波處理及EDTA抗原修復(fù)，免疫組化Envision法行SPY1標(biāo)記。鼠抗人SPY1單克隆抗體購自上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。用自身對(duì)照作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。兩位高年資病理醫(yī)師對(duì)免疫組化切片染色結(jié)果進(jìn)行雙盲法分析。SPY1免疫組化染色陽性結(jié)果為腫瘤細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色點(diǎn)狀。結(jié)果判讀參照文獻(xiàn)[5]：高倍鏡下(×400)分別對(duì)每個(gè)位點(diǎn)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，每例共計(jì)400個(gè)，按要求分別記錄染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度分值如下：0分為無著色，1分為黃色弱陽性，2分為淺棕色中陽性，3分為棕褐色強(qiáng)陽性；陽性細(xì)胞百分比根據(jù)四類計(jì)分：0分(陰性)，1分(1%～33%)，2分(34%～66%)，3分(≥67%)；兩者之和的結(jié)果作為SPY1染色的最終評(píng)分：0～3分為無或低表達(dá)，4～6分為高表達(dá)。Western blotting法:取-80 ℃冰箱保存的30例新鮮組織，蛋白質(zhì)裂解后由10%～15%的SDS-PAGE凝膠分離，濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，室溫1 h，4 ℃過夜的條件下用5%脫脂奶粉的TBST稀釋一抗孵育轉(zhuǎn)印膜(SPY1 1∶500；GAPDH 1∶1 000)溫育，洗膜后加二抗溫育。同體積混合Luminol Ecl Reagent A和B液，加入膜上，并于室溫1 min孵育；在暗室內(nèi)顯影和定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。CRC腫瘤組織與癌旁正常組織中SPY1蛋白表達(dá)差異分析及SPY1蛋白表達(dá)與各臨床病理特征間的關(guān)系分析采用Pearson卡方檢驗(yàn)；SPY1蛋白表達(dá)與CRC患者生存期關(guān)系分析采用Kaplan-Meier生存分析；單個(gè)臨床病理特征與CRC患者生存期的分析采用Log-Rank單因素生存分析；有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各臨床病理特征間的多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPY1蛋白在CRC組織中的表達(dá)及其與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系 SPY1蛋白陽性表達(dá)于CRC腫瘤組織的細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色點(diǎn)狀，低或無表達(dá)84(49.70%)例，高表達(dá)85(50.30%)例，而150例癌旁組織不表達(dá)。SPY1蛋白在CRC組織中的表達(dá)與TNM分期(χ2=9.111，P=0.011)、腫瘤浸潤深度(χ2=7.482，P=0.006)及術(shù)前血CEA值(χ2=13.988，P<0.001)有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)，見表1。Western blotting結(jié)果顯示，27例(90%)CRC組織中SPY1蛋白表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織。

表1 SPY1蛋白表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.2 預(yù)后分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示SPY1高表達(dá)組比低表達(dá)組5年生存率低(P<0.05)。Log-Rank檢驗(yàn)行單因素生存分析顯示SPY1表達(dá)程度(P<0.001)、腫瘤分化程度(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、腫瘤浸潤深度(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)及術(shù)前血CEA值(P<0.001)與術(shù)后生存時(shí)間有關(guān)，而患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤組織學(xué)類型與術(shù)后生存無關(guān)(P均>0.05)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析進(jìn)一步顯示SPY1表達(dá)程度(P=0.034)、腫瘤分化程度(P=0.002)、TNM分期(P=0.003)及術(shù)前血CEA值(P=0.003)為預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

CRC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是多因素作用的結(jié)果，而清楚認(rèn)識(shí)其某些重要的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)于CRC的早期檢測、早期診斷及靶向治療有重要意義[6～8]。SPY1是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，包括卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤等[9～11]。SPY1可參與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)生及發(fā)展[12]；在非霍奇金淋巴瘤中SPY1亦被認(rèn)為可通過調(diào)節(jié)p27的磷酸化水平介導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的增殖[13]；在肝癌中SPY1可作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和存活[14,15]；而在大腦膠質(zhì)瘤中SPY1可與CLIPR-59相互作用，抑制CLIPR-59與CLYD的結(jié)合，阻礙RIP1的去泛素化，從而介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TNF-α誘導(dǎo)凋亡的抗性[16,17]。以上研究成果證實(shí)SPY1是一種重要的癌基因。

本研究結(jié)果表明，SPY1蛋白表達(dá)與TNM分期、腫瘤浸潤深度及術(shù)前血CEA值有關(guān)。提示SPY1蛋白過表達(dá)對(duì)CRC腫瘤細(xì)胞的浸潤和侵襲能力起到一定程度的促進(jìn)作用，其可能參與CRC的惡性進(jìn)展過程。本研究還對(duì)169例CRC患者的隨訪資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SPY1高表達(dá)者5年生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者，表明SPY1高表達(dá)可增加CRC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。

總之，SPY1可作為一種促癌因子參與CRC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，可能成為CRC新的分子治療靶點(diǎn)，通過靶向藥物阻斷CRC中SPY1蛋白的表達(dá)，有可能抑制CRC的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，SPY1蛋白高表達(dá)提示CRC預(yù)后不良，可作為判斷CRC預(yù)后的獨(dú)立因子。

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張曙(E-mail:tdfyzs@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.022

R735.3

B

1002-266X(2017)09-0066-03

2016-11-14)