王 洪, 魏 杰, 李曉波, 鞏 薇, 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

生化標(biāo)記方法在KM小鼠遺傳結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

王 洪, 魏 杰, 李曉波, 鞏 薇, 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

目的 利用生化標(biāo)記檢測(cè)法分析1990年和2010年KM小鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化。方法 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14927.1-2008推薦的生化標(biāo)記檢測(cè)法對(duì)同一種群的來源KM小鼠(1990年的18只和2010年的50只)進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測(cè)，借助統(tǒng)計(jì)軟件POPGENE 1.32進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果 1990年群體的平均雜合度是0.262 5，多態(tài)性信息含量是0.206 5。2010年群體的平均雜合度是0.161 5，多態(tài)性信息含量是0.130 7。群體間比較顯示，群體間分化系數(shù)為0.122 4，遺傳距離為0.095 1。結(jié)論 經(jīng)過20年的封閉繁育，該KM小鼠群體出現(xiàn)了中度的遺傳分化，但仍屬于同一品系(同種同屬)的小鼠群體。

KM小鼠; 遺傳結(jié)構(gòu); 生化標(biāo)記

KM小鼠的前身是1926年美國(guó)Rockfeller研究所從瑞士引入白化小鼠培育成瑞士種小鼠, 1946年從印度Haffkine研究所引入我國(guó)云南昆明，1952年由昆明引入北京生物制品研究所, 1954年推廣到全國(guó)使用的一種封閉群小鼠。KM小鼠的特點(diǎn)是抗病力和適應(yīng)力很強(qiáng), 繁殖率和成活率高。常見自發(fā)性腫瘤為乳腺癌(發(fā)病率25%)，是我國(guó)應(yīng)用最多的實(shí)驗(yàn)小鼠, 廣泛應(yīng)用于藥理、毒理、病毒和細(xì)菌引起的傳染病的研究中, 以及生物制品的檢定工作中[1]。

本研究中, 應(yīng)用生化標(biāo)記方法對(duì)同一來源種群KM小鼠進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。比較1990年和2010年該群KM小鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化, 并探索生化標(biāo)記檢測(cè)法用于評(píng)價(jià)封閉群小鼠遺傳質(zhì)量的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，68只，8周齡，國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心提供[SCXK(京)2005-0004]，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(京)2011-0008]。其中18只動(dòng)物為1990年的KM小鼠，50只動(dòng)物為2010年的KM小鼠。1990年KM小鼠的檢測(cè)工作已于當(dāng)年完成，2010年KM小鼠的檢測(cè)工作已于2010年完成。兩個(gè)年份的檢測(cè)數(shù)據(jù)均屬首次發(fā)表。

1.2 試劑和儀器設(shè)備[2]

染色試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 電泳緩沖液相關(guān)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; BIO-RAD Model 3000Xi電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司; 乙酸纖維素薄膜購(gòu)自浙江臺(tái)州路橋四甲生化塑料廠。

1.3 生化標(biāo)記方法

具體方法參見GB/T14927.1-2008 近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測(cè)法[2]。測(cè)定項(xiàng)目: 酯酶-1(Es1)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf), 碳酸酐酶-2(Car2), 葡萄糖磷酸異構(gòu)酶-1(Gpi1)，血紅蛋白β鏈(Hbb)，酯酶-10(Es10)，酯酶-3(Es3)，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-1(Gpd1)，磷酸葡萄糖變位酶-1(Pgm1)，堿性磷酸酶-1(Akp1)，肽酶-3(Pep3)，蘋果酸酶-1(Mod1)，異檸檬酸脫氫酶-1(Idh1)，過氧化氫酶-2(Ce2)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用POPGEN1.32軟件，分析14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)和平均雜合度。利用Cervus3.0軟件計(jì)算群體平均多態(tài)信息含量(PIC)。按照Nei(1978)氏法計(jì)算封閉群小鼠群體的遺傳一致性指數(shù)和遺傳距離[3]。

2 結(jié)果

2.1 1990年生化標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

1990年18只KM小鼠的生化標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果見表1和表2。

14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)共檢測(cè)出23個(gè)等位基因，各基因座等位基因數(shù)1～2個(gè)不等，其中5個(gè)基因座(Es1、Trf、Akp1、Pep3、Idh1)呈現(xiàn)單態(tài)性，只有1個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為1.642 9。平均雜合度為0.262 5。Hardy-Weinberg遺傳平衡P值中，有6個(gè)位點(diǎn)P＞0.05。利用Cervus3.0軟件統(tǒng)計(jì)得到該群體的14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)的平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.206 5。剔除5個(gè)單態(tài)性位點(diǎn)，剩余9個(gè)位點(diǎn)的PIC為0.321 2。

2.2 2010年KM小鼠的生化標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

2010年50只KM小鼠的生化標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果見表3和表4。在14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)共檢測(cè)出22個(gè)等位基因, 各基因座等位基因數(shù)1～2個(gè)不等, 其中7個(gè)基因座(Es1、Trf、Gpi1、Gpd1、Akp1、Pep3、Idh1)呈現(xiàn)單態(tài)性，只有1個(gè)等位基因, 平均等位基因數(shù)為1.571 4。平均雜合度為0.161 5。Hardy-Weinberg遺傳平衡P值中，有2個(gè)位點(diǎn)P＞0.05。利用Cervus3.0軟件統(tǒng)計(jì)得到該群體的14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)的PIC為0.130 7。剔除7個(gè)單態(tài)性位點(diǎn)，剩余7個(gè)位點(diǎn)的PIC為0.261 4。

2.3 兩個(gè)年份群體遺傳相似性比較

將1990年KM小鼠生化標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與2010年的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，表明等位基因數(shù)、平均雜合度、PIC等相關(guān)指標(biāo)有一定的差異，1990年的結(jié)果略高于2010年的結(jié)果。兩個(gè)群體的PIC值均低于0.25，屬于低度多態(tài)性群體。在測(cè)定的14個(gè)位點(diǎn)中，兩個(gè)群體均有5～7個(gè)單態(tài)性位點(diǎn)，其中5個(gè)位點(diǎn)(Es1、Trf、Akp1、Pep3、Idh1)一致。兩組數(shù)據(jù)中有5個(gè)顯著性差異的位點(diǎn)，分別是Car2，Gpi1，Gpd1和Ce2 (P＜0.01); 和1個(gè)位點(diǎn)Mod1(0.01＜P＜0.05)。

進(jìn)一步分析兩個(gè)群體的群間分化系數(shù)(Fst)、遺傳一致性指數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 平均雜合度、多態(tài)性信息含量和遺傳平衡

較理想的封閉群群體的雜合度值應(yīng)介于0.5～0.7[4]。本研究中1990年該KM小鼠群體的平均雜合度是0.262 5, 2010年該群體的平均雜合度是0.161 5。1990年的數(shù)據(jù)略高于2010年的數(shù)據(jù)。顯然，兩個(gè)年度的群體雜合度都沒有達(dá)到0.5～0.7，都不是理想的封閉群小鼠群體。多態(tài)性信息含量是表示生化標(biāo)記多態(tài)性高低的一個(gè)指標(biāo)。本研究中1990年該小鼠群體的平均多態(tài)性信息含量為0.206 5, 2010年該群體的平均多態(tài)性信息含量為0.130 7。兩個(gè)年份的多態(tài)性信息含量均小于0.25，為低度多態(tài)性群體。如果排除單態(tài)性位點(diǎn)，1990年和2010年的PIC分別為0.321 2和0.261 4，介于0.25～0.5，為中度多態(tài)性群體。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，1990年該群體小鼠有6個(gè)位點(diǎn)處于遺傳平衡(P＞0.05), 高于2010年該群體小鼠, 后者僅有2個(gè)位點(diǎn)(P＞0.05)。說明該群體的平均雜合度和多態(tài)性信息含量都有下降的趨勢(shì)，同時(shí)也表明單態(tài)性位點(diǎn)不適用于封閉群群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析，應(yīng)增加多態(tài)性位點(diǎn)的數(shù)量替代單態(tài)性位點(diǎn)，以提高生化標(biāo)記檢測(cè)法的檢測(cè)效率。在封閉繁育過程中，可能由于群體規(guī)模的限制, 繁殖方式的不規(guī)范, 造成基因多態(tài)性的遞減, 進(jìn)而出現(xiàn)群體遺傳結(jié)構(gòu)特征的變化。研究結(jié)果提示對(duì)封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體定期(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定是1年)進(jìn)行遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的必要性。同時(shí)也證明生化標(biāo)記檢測(cè)法用于群體遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)的可行性。

表 1 1990年KM小鼠生化標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Table 1 Biochemical marker testing result at 1990 in KM mice

表 2 1990年KM小鼠在14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)上的等位基因數(shù)、平均雜合度、多態(tài)性信息含量Table 2 Allele number, average heterozygosity and polymorphism information content (PIC) of 14 biochemical loci at 1990 in KM mice

表 3 2010年KM小鼠生化標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Table 3 Biochemical marker testing result at 2010 in KM mice

續(xù)表3

3.2 群間分化系數(shù)、遺傳一致性指數(shù)和遺傳距離

群間分化系數(shù)(Fst)是測(cè)定群體間遺傳分化的主要參數(shù)，F(xiàn)st＜0.05時(shí)，表示群體間有輕度遺傳分化; 0.05≤ Fst＜0.15時(shí)，表示群體間有中度遺傳分化; 0.15≤Fst＜0.25時(shí)，表示群體間有中重度遺傳分化; Fst≥0.25時(shí)，表示群體間有重度遺傳分化，群體差異顯著[5]。本研究中兩個(gè)年份KM小鼠群體的群間分化系數(shù)為0.122 4，介于0.05和0.15，表明兩個(gè)群體間產(chǎn)生了中度的遺傳分化。遺傳一致性指數(shù)與遺傳距離是反映群體遺傳相似性的兩個(gè)指標(biāo)，兩者呈負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，其中，遺傳距離為顯性函數(shù)，且當(dāng)遺傳距離大于0.2時(shí)，認(rèn)為兩個(gè)群體為同屬不同種; 在0.03～0.2時(shí)為同屬同種[5]。本研究中兩個(gè)年份該小鼠群體的遺傳一致性指數(shù)為0.909 3;遺傳距離介于0.03和0.2，為0.095 1，表明這該群體仍屬于同種同屬(同一品系)的動(dòng)物。研究結(jié)果表明該KM小鼠群體的遺傳結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了改變，但仍屬于同一個(gè)品系的動(dòng)物。繁育機(jī)構(gòu)可以根據(jù)檢測(cè)結(jié)果適時(shí)調(diào)整繁育和生產(chǎn)計(jì)劃，達(dá)到控制封閉群群體遺傳質(zhì)量的目的。

表 4 2010年KM小鼠在14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)上的等位基因數(shù)、平均雜合度、多態(tài)性信息含量Table 4 Allele number, average heterozygosity and polymorphism information content (PIC) of 14 biochemical loci at 2010 in KM mice

表 5 兩個(gè)KM小鼠群體的遺傳參數(shù)Table 5 Genetic parameters in two colonies of KM mice

3.3 生化標(biāo)記方法的局限性

1994年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布，2001年經(jīng)過第一次修訂, 兩個(gè)版本中均未提及封閉群動(dòng)物的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)。從1994至2010年的16年中封閉群群體遺傳質(zhì)量控制處于缺失狀態(tài)。2010年12月23日 “GB 14923-2010哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制”正式發(fā)布，替代原有版本GB 14923-2001, 其重大變化在于新增的指導(dǎo)原則: 要求對(duì)封閉群動(dòng)物進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測(cè)。具體的檢測(cè)方法推薦使用生化標(biāo)記檢測(cè)法、下頜骨測(cè)量法、DNA檢測(cè)法等。其中生化標(biāo)記檢測(cè)法是“GB/T 14927.1-2008近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測(cè)法”。此前，該方法主要用于對(duì)近交系動(dòng)物進(jìn)行遺傳質(zhì)量控制。

研究結(jié)果表明，1990年的群體表現(xiàn)為多態(tài)性的兩個(gè)位點(diǎn)(Gpi1和Gpd1)，在2010年的群體中已經(jīng)呈現(xiàn)為單態(tài)性了。1990年和2010年兩組數(shù)據(jù)中有5個(gè)顯著性差異的位點(diǎn), 分別是Car2, Gpi1, Gpd1和Ce2 (P＜0.01); 和1個(gè)位點(diǎn)Mod1(0.01＜P＜0.05)。占總數(shù)(14個(gè)位點(diǎn))的35.71%。說明群體的遺傳結(jié)構(gòu)特征已經(jīng)發(fā)生變化，群體的雜合程度趨于減弱。遺傳背景發(fā)生改變的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必然對(duì)該動(dòng)物參與的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此, 應(yīng)重視封閉群動(dòng)物群體遺傳質(zhì)量的評(píng)價(jià)，減少和避免由此給科研工作帶來的負(fù)面影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)生化標(biāo)記分析法, 是通過蛋白質(zhì)的變化推測(cè)相應(yīng)基因的變化[6-7]。生化標(biāo)記分析在近交系動(dòng)物遺傳檢測(cè)中，具有檢測(cè)的基因位點(diǎn)明確、方法簡(jiǎn)便快速、比較經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)[5]。本研究數(shù)據(jù)揭示了該KM小鼠群體的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征的變化趨勢(shì)。但是, 14個(gè)位點(diǎn)中有近50%的位點(diǎn)已經(jīng)表現(xiàn)為單態(tài)性。單態(tài)性的位點(diǎn)對(duì)于群體遺傳結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)來說, 是無效的位點(diǎn)。本研究中的有效位點(diǎn)為7～9個(gè), 位點(diǎn)太少的情況下, 并不能客觀真實(shí)地反映群體的遺傳結(jié)構(gòu)特征。因此, 生化標(biāo)記方法需要進(jìn)一步完善，應(yīng)增加多態(tài)性豐富的位點(diǎn)的數(shù)量, 并且位點(diǎn)應(yīng)全面覆蓋小鼠的所有染色體。

綜上，本文應(yīng)用生化標(biāo)記檢測(cè)法對(duì)封閉群KM小鼠群體進(jìn)行了遺傳質(zhì)量檢測(cè)，分析了同一個(gè)飼養(yǎng)設(shè)施內(nèi)20年前后同一品系封閉群小鼠的遺傳結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明該群體的群體遺傳結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生變化。封閉群實(shí)驗(yàn)小鼠的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征處于動(dòng)態(tài)變化之中，應(yīng)定期對(duì)封閉群群體的遺傳質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，來保證封閉群實(shí)驗(yàn)小鼠的群體遺傳結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)平衡之中。進(jìn)而保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可比性。本研究結(jié)果也為生化標(biāo)記檢測(cè)方法應(yīng)用于封閉群小鼠的群體遺傳質(zhì)量控制提供了數(shù)據(jù)支撐。(致謝：特別感謝賀爭(zhēng)鳴研究員對(duì)本文的耐心指導(dǎo)。)

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Application of Biochemical Markers on Analysis of Population Genetic Structure in KM mice

WANG Hong, WEI Jie, LI Xiao-bo, GONG Wei, YUE Bing-fei
(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050 China)

ObjectiveTo analyze the change of genetic structure of KM mice colonies between 1990 and 2010.MethodsKM mice colonies (18 mice in 1990 and 50 mice in 2010) were monitored by biochemical markers under instruction of national standard GB/T 14927.1-2008. POPGENE 1.32 software was used to process the data.ResultsIn 1990, average heterozygosity is 0.262 5, polymorphism information content is 0.206 5. In 2010, average heterozygosity is 0.161 5, polymorphism information content is 0.130 7. By compared with the two colonies, population differentiation coefficient is 0.122 4 and the genetic distance is 0.095 1.ConclusionAfter 20 years outdred, the KM colony has medium change of population differentiation , but still be considered as same strain from the point of population genetics.

KM mice; Genetic structure; Biochemical markers

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0144-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.012

2016-11-28

王 洪(1977-), 女, 副研究員。研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制。E-mail: littstar@163.com

岳秉飛(1960-), 男, 博士, 研究員。E-mail: y6784@126.com