劉 帥， 童朝陽， 劉 冰

(國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

綜述與評(píng)論

絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器*

劉 帥， 童朝陽， 劉 冰

(國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

對(duì)絲網(wǎng)印刷電極及其應(yīng)用于電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的功能化及信號(hào)放大修飾進(jìn)行綜述，歸納了該檢測(cè)體系在抗體、核酸、氧化酶底物、腫瘤細(xì)胞、病原菌、抗生素等物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用，最后對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行了展望。

絲網(wǎng)印刷電極； 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器； 功能化； 信號(hào)放大； 應(yīng)用

0 引 言

電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)傳感器將電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、可控性好、響應(yīng)快速、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，特別適用于復(fù)雜物質(zhì)的痕量、超痕量檢測(cè)，近年來在環(huán)境分析、生物檢測(cè)、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域發(fā)展迅速，并已出現(xiàn)成熟的商業(yè)化設(shè)備。但是傳統(tǒng)ECL傳感器構(gòu)架過大，比較笨重，往往只能在實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院等固定環(huán)境使用，很難便攜應(yīng)用到野外環(huán)境；且使用前后需要仔細(xì)清洗，不僅消耗大量時(shí)間和試劑，也可能因清洗不凈給檢測(cè)帶來干擾。

絲網(wǎng)印刷電極(screening printed electrode，SPE)采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備而成，能夠簡單、快速、高效地批量生產(chǎn)，電極重現(xiàn)性強(qiáng)且成本很低。SPE可作為微型反應(yīng)池使用，能夠促進(jìn)ECL傳感器的小型化改進(jìn)，為野外現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)、生化戰(zhàn)劑檢測(cè)等創(chuàng)造了良好條件。同時(shí)由于成本較低，電極可一次性使用，能夠避免傳統(tǒng)ECL反應(yīng)池因清洗不凈產(chǎn)生的背景干擾?；诮z網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)發(fā)光傳感器(SPE-ECL傳感器)具有種種優(yōu)勢(shì)，在發(fā)展微型化、集成化、智能化的原位檢測(cè)設(shè)備方面擁有廣闊的應(yīng)用前景，成為近年來ECL傳感器研究的熱點(diǎn)，本文主要在相關(guān)方面進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 絲網(wǎng)印刷電極材料、基底及結(jié)構(gòu)體系

1.1 SPE材料

SPE一般由工作電極、對(duì)電極、參比電極和導(dǎo)電軌組成。其中，工作電極主要分為碳電極和金屬電極。碳電極是應(yīng)用最廣泛的工作電極，印刷油墨為碳漿，由石墨粉和一些疏水性的粘合劑組成，具有材料廉價(jià)、制作簡單等優(yōu)勢(shì)。金屬電極最常用的原料是金膏。金電極具有極強(qiáng)的導(dǎo)電性和穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，更重要的是，強(qiáng)大的金硫鍵作用使得電極表面極容易形成自組裝層，有利于含硫物質(zhì)的固定和其生物活性的保留，這些優(yōu)勢(shì)可大幅提高檢測(cè)靈敏度和操作便捷性，只是較高的成本對(duì)其應(yīng)用有所限制，此外Pt,Ag,Au-Pt合金等金屬電極也有使用。對(duì)電極的材料一般和工作電極一致。參比電極主要采用Ag/AgCl混合油墨制備，導(dǎo)電軌的材料為銀漿，銀是SPE制備中除碳以外最常用的材料。

1.2 SPE基底

SPE基底擁有大量可選擇材質(zhì)，最普遍使用的是塑料和陶瓷，它們來源廣泛、成本低廉、疏水且惰性、適用范圍廣。此外，一些常見的柔性基底材料如紙張和布匹也有使用，它們賦予了SPE一些新穎設(shè)計(jì)。

1) 陶瓷

陶瓷是典型的硬性材質(zhì)，具有耐磨、耐高溫、耐腐蝕特性，尤其適用作金屬電極的基底。但是陶瓷硬度過大而韌性較差，與電子設(shè)備的兼容性往往有所不足。

2)塑料

塑料質(zhì)地輕、耐酸堿、價(jià)格極低，相比于陶瓷耐溫性能差，但具有更好的韌性。常用塑料類型有PVC(聚氯乙烯)、PET(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇脂)、PC(聚碳酸酯)等。

3)紙張

以紙張作為電極基底的思路來源于Whitesides等人設(shè)計(jì)的微流紙基分析設(shè)備[1～3]。紙基電極以三維折疊結(jié)構(gòu)最為巧妙，將三電極分別印刷于兩面經(jīng)過疏水處理的紙張，使用時(shí)將紙張對(duì)疊即可形成完整的三電極電化學(xué)小室。三維折疊紙基電極具有價(jià)格低廉、制備簡單、便于攜帶、易于操作等特點(diǎn)，常應(yīng)用到ECL傳感器中[4～6]。

4)布匹

受紙基電極的啟發(fā)，也有學(xué)者將布基電極應(yīng)用于ECL檢測(cè)[7]。布基電極與紙基電極類似，具有便于制備、材料廣泛、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)。甚至有學(xué)者[8]將SPE印到衣物上，通過與皮膚接觸監(jiān)測(cè)血壓、心率等體征，利用傳感設(shè)備遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)病人病情，可對(duì)潛在的中風(fēng)和糖尿病病情變化進(jìn)行預(yù)警，是極具實(shí)用性的創(chuàng)新。

1.3 SPE結(jié)構(gòu)體系

應(yīng)用于ECL傳感器的SPE一般均采用三電極系統(tǒng)。從構(gòu)造上看，三電極系統(tǒng)根據(jù)工作電極數(shù)目的不同，可以分為單通路體系和多通路體系。另外還有一種特殊的三電極體系：雙極性電極(bipolar electrode，BPE)體系。

1)單通路三電極體系

單通路三電極體系是SPE最常用的結(jié)構(gòu)體系，由1個(gè)工作電極、1個(gè)參比電極和1個(gè)對(duì)電極組成。

2)多通路三電極體系

多通路體系擁有2個(gè)或更多工作電極。對(duì)每個(gè)工作電極施加不同電勢(shì)進(jìn)行ECL反應(yīng)，可用于測(cè)量樣品中的多種物質(zhì)，而無需更換電極。

3)雙極性電極體系

BPE體系比較新穎，2001年首次引入ECL檢測(cè)技術(shù)[9]。BPE由2個(gè)驅(qū)動(dòng)電極和1個(gè)工作電極組成。驅(qū)動(dòng)電極連接電源，工作電極浸入中間溶液池，與外電源分隔，靠近陽極驅(qū)動(dòng)電極的一側(cè)起著陰極的作用，另一側(cè)相反，因此同一塊工作電極具有陰陽兩極屬性。溶液池尺寸足夠小而阻抗極大，以至于BPE兩端的實(shí)際電壓與其長度呈線性關(guān)系。當(dāng)電壓足夠大時(shí)，BPE兩極同時(shí)發(fā)生氧化還原過程，從而根據(jù)產(chǎn)生的ECL反應(yīng)進(jìn)行測(cè)量。目前已有多名學(xué)者運(yùn)用BPE進(jìn)行ECL檢測(cè)[10,11]，未來具有非常廣闊的發(fā)展空間。

2 SPE-ECL傳感器的電極功能化修飾及信號(hào)放大修飾

2.1 基于SPE-ECL傳感器的電極功能化修飾

SPE可作為多種ECL傳感器的芯片，其功能化修飾決定了傳感器的特異性和靈敏度。常見SPE-ECL傳感器的功能分子有酶、抗體、適配體、分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)等，根據(jù)其特性選擇相應(yīng)的功能化方法。

1)氧化酶：作為ECL酶傳感器的功能分子，氧化酶的固定通常采用包埋法，用聚合物將其包裹覆蓋到電極表面，通過聚合物孔隙與底物接觸并反應(yīng)。常用的包埋物有聚丙烯酰胺、聚丙烯醇、殼聚糖、全氟磺酸膜(Nafion膜)等。

2)抗體：抗體功能化方法較多，主要有戊二醛交聯(lián)法、EDC-NHS法、自組裝法、生物素—親和素法等。其中自組裝法和生物素—親和素法應(yīng)用較廣，前者主要用于金電極或者金納米材料修飾電極，利用金硫鍵作用將抗體吸附在電極表面，其優(yōu)點(diǎn)是簡單直接，能夠有效保留抗體生物活性；后者主要通過親合素的“橋梁”作用，將生物素化抗體固定在SPE表面。1個(gè)親和素分子能夠結(jié)合4個(gè)生物素分子，可有效增加抗體固載量，提高傳感靈敏度。

3)適配體：適配體容易進(jìn)行巰基化、氨基化和生物素化修飾，因此常用自組裝法、EDC-NHS法和生物素—親和素法固定，處理流程與抗體類似。適配體可以和靶分子特異性、高強(qiáng)度結(jié)合，在不同檢測(cè)模式的ECL傳感器中得到了廣泛應(yīng)用[12～14]。

4)分子印跡聚合物：MIPs利用分子印跡技術(shù)制備而成，具有特異性識(shí)別功能，可作為捕獲探針構(gòu)建新型的分子印跡傳感器，這是ECL檢測(cè)領(lǐng)域的全新方向[15]。MIPs通常在電極表面通過電聚合、光聚合、溶膠—凝膠法等直接合成。比較新穎的方法是合成磁性MIPs，利用磁力作用吸附在電極表面[16]，檢測(cè)完成后將其洗去，電極可重復(fù)利用多次。

2.2 基于SPE-ECL傳感器的電極信號(hào)放大修飾

為提高傳感器的檢測(cè)靈敏度，除基本的功能化修飾外，采用納米材料對(duì)電極進(jìn)行信號(hào)放大是最有效的方法。一方面納米材料巨大的比表面積可以大幅提高ECL標(biāo)簽的富集密度；另一方面其獨(dú)特的表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)、介電限域效應(yīng)等使其具有不同尋常的電、熱、光、磁特性，能夠有效提高電極性能。常用于SPE修飾的納米材料有：

1)石墨烯

石墨烯是碳的二維同素異形體，是由單原子層組成的穩(wěn)定正六邊形結(jié)構(gòu)，具有極其出色的光電特性[17～19]。作為新世紀(jì)的明星分子，石墨烯不僅常用作信號(hào)放大材料[4,5]，同時(shí)也能夠制備出量子點(diǎn)作為ECL標(biāo)簽使用[20]。

2)碳納米管

碳納米管擁有巨大的比表面積、優(yōu)秀的導(dǎo)電性能和獨(dú)特的管狀結(jié)構(gòu)，逐漸成為ECL信號(hào)放大的基礎(chǔ)材料。碳納米管便于裝載其它納米粒子組成復(fù)合材料[21]，常摻雜在Nafion等聚合物膜中對(duì)電極修飾[22]，能夠有效提高傳感靈敏度。

3)金屬納米材料

Au納米粒子制備成熟，尺寸可控，物化性質(zhì)長期穩(wěn)定，具有極好的導(dǎo)電性和生物相容性，對(duì)部分ECL反應(yīng)還有催化功能[23]。同時(shí)Au修飾電極表面適用自組裝方法，可簡化含硫功能分子的固定，并有效保留生物活性。這些優(yōu)勢(shì)使它成為電極修飾中最常用的納米粒子。其它金屬如Pt,Pd,Ag納米粒子應(yīng)用相對(duì)較少，但也有良好的增敏作用[21,24,25]。

除顆粒形態(tài)外，一類納米多孔材料應(yīng)用越加廣泛，其主要特點(diǎn)是：孔隙分布均勻，連續(xù)性結(jié)構(gòu)使它們更容易在電極固定；相互關(guān)聯(lián)的中空通道有利于大規(guī)模的電子運(yùn)輸，提高電極的導(dǎo)電性能；巨大的比表面積和一定的孔容積，使其具有強(qiáng)吸附性和固載能力。納米多孔金(nanoporous gold，NPG)、納米多孔銀(nanoporous silver，NPS)作為多孔金屬材料的典型代表，近年來在ECL檢測(cè)中受到很多學(xué)者的青睞[5,6]。

4)金屬氧化物納米材料

金屬氧化物中比較常用的納米材料有TiO2和ZnO，兩者均為半導(dǎo)體材料。TiO2粘附力強(qiáng)，物化性質(zhì)穩(wěn)定，主要以納米粒子[26]和納米管陣列[27]兩種形態(tài)修飾電極。其中，TiO2納米管陣列是經(jīng)特殊處理形成的中空納米尺度材料，具有大表面積和空隙容積，以及垂直于基底表面的規(guī)則陣列，可有效增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。

ZnO納米粒子是球狀透明材料，具有良好的生物相容性和電化學(xué)性能。作為第二副族和氧族元素的化合物，ZnO和CdS,CdSe等量子點(diǎn)類ECL標(biāo)簽具有相似的結(jié)構(gòu)組成，常和納米修飾材料或量子點(diǎn)組成復(fù)合物，用以提高ECL檢測(cè)效果[12,22]。

5)非金屬氧化物納米材料(SiO2)

3 SPE-ECL傳感器在生物檢測(cè)中的應(yīng)用

電極完成功能化和信號(hào)放大修飾后，即可進(jìn)行檢測(cè)。常見檢測(cè)包括蛋白質(zhì)、核酸、氧化酶底物、腫瘤細(xì)胞、病原菌、抗生素等，如表1所示。

3.1 蛋白質(zhì)

1)抗體

2)腫瘤標(biāo)志物

3.2 核 酸

3.3 氧化酶底物

3.4 細(xì)胞與細(xì)胞生物體

1)腫瘤細(xì)胞

腫瘤患者除利用各種標(biāo)志物表征病情外，還可直接用細(xì)胞數(shù)進(jìn)行衡量。Yu課題組以碳量子點(diǎn)包被的ZnO毫微球作為ECL標(biāo)簽，用NPG修飾電極，依靠形成的適配體—K562細(xì)胞—ECL標(biāo)簽的夾心結(jié)構(gòu)，對(duì)白血病細(xì)胞K562的檢測(cè)范圍達(dá)到1.0×102～2.0×107cell/mL，檢出限為46 cell/mL，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值[12]。

2)病原菌

Anna-Maria等人[41]使用絲網(wǎng)印刷金電極陣列對(duì)土拉熱弗朗西絲菌進(jìn)行ECL檢測(cè)，分別采用全抗體和Fab抗體片段作為捕獲探針，檢測(cè)限相應(yīng)為70,45 cell/mL。除此以外，也可通過檢測(cè)細(xì)菌源DNA進(jìn)行間接定量。他們[42]利用三核酸夾心結(jié)構(gòu)，同時(shí)檢測(cè)炭疽芽孢桿菌、馬爾他布魯桿菌、土拉熱弗朗西絲菌、鼻疽伯克霍爾德菌、伯內(nèi)特考克斯體、蘇云金芽孢桿菌6種病原菌，檢測(cè)限分別為1.2，1.0，0.8，0.8，0.6，0.8 nmol/L。

3.5 抗生素

表1 基于絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)發(fā)光傳感器在生物檢測(cè)中的應(yīng)用

4 結(jié) 論

SPE-ECL傳感器具有小型化優(yōu)勢(shì)，可便攜至野外進(jìn)行原位測(cè)量；電極可一次性使用，避免檢測(cè)前后的清洗工作，操作便捷且沒有因清洗不凈帶來的干擾。同時(shí)還具有傳統(tǒng)ECL傳感器的靈敏度高、重現(xiàn)性和可控性好、分析速度快等優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的發(fā)展前景。目前,SPE-ECL分析技術(shù)已成功檢測(cè)抗體、腫瘤標(biāo)志物、核酸、氧化酶底物、腫瘤細(xì)胞、病原菌、抗生素等物質(zhì)，極低的檢測(cè)限和寬檢測(cè)范圍展示了該傳感系統(tǒng)巨大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展空間。但是,目前整個(gè)系統(tǒng)的理論研究還不夠深入，電極的信號(hào)放大修飾方案不夠系統(tǒng)化。從近期來看，應(yīng)當(dāng)著眼于信號(hào)放大材料的選擇與組合，針對(duì)待測(cè)物的性質(zhì)，逐步完善ECL增敏的電極修飾方案，結(jié)合不同功能材料和ECL標(biāo)簽的檢測(cè)效果，篩選建立最適合的檢測(cè)模式和流程。從長遠(yuǎn)來看，ECL反應(yīng)的細(xì)致機(jī)理及精確的動(dòng)力學(xué)過程還需深入探究，ECL標(biāo)簽和信號(hào)放大材料仍可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和篩選。未來應(yīng)當(dāng)結(jié)合材料學(xué)和表面物理學(xué)等相關(guān)學(xué)科建立改善電極性能的操作方法，使檢測(cè)效果更加精細(xì)和可控，推動(dòng)SPE-ECL傳感器向著微型化、集成化、智能化的方向快速發(fā)展。

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[44] Feng Xiaobin,Gan Ning,Li Tianhua,et al.A novel“dual-potential”electrochemiluminescence aptasensor array using CdS quantum dots and luminol-gold nanoparticles as labels for simultaneous detection of malachite green and chloramphenicol[J].Biosensors and Bioelectronics,2015,74:587-593.

童朝陽(1972-)，通訊作者，男，博士，研究員，從事生物傳感與生物檢測(cè)工作，E—mail：billzytong@126.com。

Electrochemiluminescence biosensor based on screening printed electrode*

LIU Shuai, TONG Zhao-yang, LIU Bing

(State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian,Beijing 102205,China)

Screening printed electrode and its functionalized and signal amplified modifications for the electrochemiluminescence detection are reviewed,applications of the detection system in antibodies,nucleic acids,oxidase substrates,tumor cells pathogens,antibiotics and so on are generalized,and its future developments are prospected.

screening printed electrode； electrochemiluminescence biosensor； functionalization； signal amplification； application

10.13873/J.1000—9787(2017)05—0001—05

2017—03—06

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2016YFF0103103)

TP 212

A

1000—9787(2017)05—0001—05

劉 帥(1993-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)殡娀瘜W(xué)發(fā)光傳感技術(shù)。