郭立泉, 尹煥才,2, 田晶晶,2

(1.中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163；2.中國科學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)重點實驗室，江蘇 蘇州 215163)

LED激發(fā)光源的熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)設(shè)計*

郭立泉1, 尹煥才1,2, 田晶晶1,2

(1.中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163；2.中國科學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)重點實驗室，江蘇 蘇州 215163)

針對食品和生化檢測中常見的熒光物質(zhì)4—甲基傘形酮(4-MU)的檢測問題，提出了一種基于熒光分析法的熒光物質(zhì)快速檢測方法，并以LED作為激發(fā)光源，設(shè)計了便攜式高靈敏度的熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)，并給出電路實現(xiàn)。對系統(tǒng)與多功能酶標儀進行了對比標定和測試，結(jié)果表明：所設(shè)計的系統(tǒng)線性度為0.997，檢測誤差小于1.5 %，響應(yīng)時間小于0.5 s，這對于食品和生化熒光物質(zhì)檢測設(shè)備的開發(fā)，具有一定的參考意義。

4-甲基傘形酮； 熒光； 熒光物質(zhì)； 快速檢測

0 引 言

4-甲基傘形酮(4-MU)作為一種常見的熒光指示劑，激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長450 nm，具有良好的穩(wěn)定性[1，2]。4-MU具有多種衍生物，包括糖苷類、酯(脂)類、肽類等，常作為熒光底物被用于病原微生物、生化指標的檢測。其原理是,樣本中特異性酶可以酶解熒光底物，釋放出熒光基團(4-MU)，進而通過紫外燈照射顯色，或通過儀器采集分析產(chǎn)生的熒光信號，用于相應(yīng)酶的含量及酶活力的測定，從而實現(xiàn)某些基因缺陷性疾病或食源性致病菌含量的檢測[3～6]。

相對于傳統(tǒng)顯色研究方法，熒光法靈敏性高、特異性好，具有更低的檢測限, 檢測靈敏度達fmol級。因此，近幾年應(yīng)用該方法的研究報告也日益豐富。在4-MU檢測時大多使用熒光光譜儀、多功能酶標儀等大型實驗室類儀器設(shè)備。對于小樣本檢測和現(xiàn)場檢測而言，其價格相對昂貴，儀器維護成本較高，并且不方便移動。因此，小型化便攜式的檢測系統(tǒng)對于解決上訴問題提供了一種有效途徑。

針對4-MU的檢測問題，本文設(shè)計了一種基于LED激發(fā)光源調(diào)制和解調(diào)的便攜式熒光信號采集系統(tǒng)，實現(xiàn)了對熒光產(chǎn)物的低噪聲、高靈敏度和快速檢測。

1 基于LED激發(fā)光源的熒光物質(zhì)檢測基本原理

對4-MU進行定向的修飾，可得到各種衍生物。目前，香豆素類熒光底物包括糖苷類、磷酸酯類、羧酸酯類、硫酸酯類、肽類等。這些底物中，糖苷類熒光底物(MUG)的研究和應(yīng)用最為廣泛,MUG在糖苷酶的作用下發(fā)生水解，生成熒光產(chǎn)物4-MU[7]。

以超高亮LED作為激發(fā)光源，照射在4-MU上，激發(fā)產(chǎn)生熒光，激發(fā)光和熒光的光譜圖如圖1所示?？梢钥闯觯?-MU的最佳激發(fā)波長范圍為320～380 nm，熒光中心波長為450 nm。因此，選擇中心波長為365 nm的LED，輔以中心波長365 nm帶寬為40 nm的濾光片作為激發(fā)光源。熒光檢測端由中心波長為450 nm帶寬為20 nm的窄帶濾光片進行濾波后，接收熒光信號，二者沒有波長重疊，可實現(xiàn)對4-MU的檢測。

圖1 4-MU的LED激發(fā)光與發(fā)射光光譜

2 基于LED激發(fā)光源的熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)設(shè)計

2.1 系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)框圖

基于LED激發(fā)光源的熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)的總體結(jié)構(gòu)如圖2所示。主要包括主控制器和信號采集模塊、LED光源調(diào)制與恒流驅(qū)動模塊、光學(xué)系統(tǒng)模塊、熒光和參考光檢測模塊等幾個部分。

圖2 基于LED激發(fā)光源的熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)總體框圖

主控制器和信號采集與處理部分采用STM32F373進行設(shè)計，STM32F373集成16位高精度的A/D和16位的PWM以及其他豐富的外設(shè)資源，非常適合用于LED激發(fā)光源與熒光檢測系統(tǒng)的設(shè)計。

STM32F373的PWM發(fā)出100 kHz的方波信號，通過高速模擬開關(guān)，對LED壓控恒流源驅(qū)動電路進行調(diào)制，使LED發(fā)出頻率為100 kHz的穩(wěn)定的激發(fā)光。激發(fā)光一路經(jīng)過365 nm濾光片照射在被測樣品上，產(chǎn)生中心波長為450 nm的熒光信號，另一路經(jīng)450 nm濾光片后由光電探測器檢測，得到電壓信號。由于熒光信號和得到的電壓信號非常微弱，進一步設(shè)計了信號放大電路、100 kHz低通濾波電路、二級放大電路等信號調(diào)理電路對信號進行調(diào)理。最后，對于放大的100 kHz電壓信號進行解調(diào)，得到濾除噪聲和干擾的直流電壓信號，進而由STM32F373的16位A/D進行模/數(shù)轉(zhuǎn)換和處理。

為了進一步降低背景光、光源波動、光源衰減等帶來的檢測誤差，設(shè)計了參考光檢測電路，參考光檢測電路和熒光檢測電路采用同樣的電路設(shè)計。

2.2 檢測系統(tǒng)電路設(shè)計

在基于LED激發(fā)光源的熒光物質(zhì)快速檢測電路中，LED光源調(diào)制和恒流驅(qū)動以及信號解調(diào)電路是降低系統(tǒng)噪聲、降低檢測下限的關(guān)鍵[8]，下面將分別對熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)中的關(guān)鍵電路進行設(shè)計和分析。

2.2.1 LED激發(fā)光調(diào)制和恒流驅(qū)動電路

激發(fā)光源的穩(wěn)定性是熒光檢測系統(tǒng)中的關(guān)鍵，光源的不穩(wěn)定將影響系統(tǒng)穩(wěn)定性并產(chǎn)生檢測誤差。因此，熒光檢測系統(tǒng)中，采用低紋波的壓控恒流源作為LED的驅(qū)動電源，同時，可以通過調(diào)節(jié)電壓的大小調(diào)節(jié)驅(qū)動電流的大小。

壓控恒流源電路如圖3(a)所示，STM32F373通過管腳3(DAC0)直接輸出設(shè)定的電壓值，接入運放同相輸入端，根據(jù)“虛短”的概念，電阻器R2兩端的電壓V=DAC0，為恒定值，流過R2的電流I=V/R2，也為恒定值。再根據(jù)“虛斷”的概念，流過R2的電流不流入運放，只流過Q1,Q2,Q3,Q4組成的威爾遜鏡像恒流源，因此，LED的驅(qū)動電流LedCur+=DAC0/R2為恒定值，且可通過DAC0設(shè)定恒定電流的大小。

為了排除背景光等雜散光的影響并進一步提高信噪比，以100 kHz的方波對光源進行調(diào)制，光源調(diào)制電路如圖3(b)右圖所示。STM32F373的PWM產(chǎn)生100 kHz的方波，通過高速模擬開關(guān)對LedCur+進行通斷控制，從而實現(xiàn)對LED激發(fā)光源的調(diào)制。

圖3 LED的恒流驅(qū)動電路與光源調(diào)制電路

2.2.2 光電轉(zhuǎn)換電路與帶通濾波電路

光電轉(zhuǎn)換電路主要用來將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，一般包括光電探測器與I/V(電流/電壓)轉(zhuǎn)換電路。由于熒光信號非常微弱，這對光電探測器以及I/V轉(zhuǎn)換電路的靈敏度都提出了很高的要求。系統(tǒng)中，采用了Pacific Silicon Sensor公司的快速響應(yīng)光電二極管作為光電探測器。

I/V轉(zhuǎn)換電路采用了一種基于T型網(wǎng)絡(luò)的高靈敏度I/V轉(zhuǎn)換器，如圖4(a)所示，可知

(1)

式中 i為光電二極管的輸出電流;V為I/V轉(zhuǎn)換電路的輸出電壓。合理選擇R6，R7，R9等電阻值就能實現(xiàn)高靈敏度。

圖4 T型網(wǎng)絡(luò)I/V轉(zhuǎn)換電路和100 kHz帶通濾波電路

I/V轉(zhuǎn)換得到的電壓信號，含有直流分量、噪聲以及其它干擾量，傳統(tǒng)的低通濾波電路并不能濾除直流分量的干擾，系統(tǒng)通過基于光源調(diào)制—解調(diào)的巧妙設(shè)計，可完全消除直流分量的影響。由于光源調(diào)制的方波為100 kHz，因此，濾波電路采用了100 kHz巴特沃斯帶通濾波電路進行設(shè)計，只有100 kHz的熒光信號可以通過，其他背景光、雜散光以及噪聲信號等可以完全濾除。

100 kHz帶通濾波電路如圖4(b)圖示，R10,C2和C1,R11分別決定高截止頻率和低截止頻率，選擇合適的阻容值，將帶通濾波范圍設(shè)置在99 kHz和101 kHz之間。R1,R5和R8決定濾波電路的品質(zhì)因數(shù)和增益。

2.2.3 信號解調(diào)電路及后置放大電路

對于調(diào)制的100 kHz信號，設(shè)計了全波精密檢波電路，作為信號解調(diào)電路，對100 kHz熒光信號進行解調(diào)，從而得到直流的熒光信號。全波精密檢波電路如圖5所示，包括半波整流器電路、加法電路和低通濾波器電路。信號通過精密半波整流電路和加法電路組成的全波整流電路進行全波整流，然后經(jīng)二階巴特沃斯低通濾波器取出低頻成分，從而獲得解調(diào)的熒光電壓信號。

圖5 100 kHz信號解調(diào)電路

對于解調(diào)得到的熒光信號電壓值，需要進一步放大到A/D檢測的范圍，以提高檢測精度和分辨率。后置二級放大電路采用常規(guī)的比例放大電路，電路相對比較簡單，這里不再給出具體電路和設(shè)計分析。

2.3 數(shù)據(jù)采集與處理

經(jīng)過信號調(diào)理的熒光信號電壓和參考光信號電壓，由STM32F373兩個通道的16位差分AD進行模/數(shù)轉(zhuǎn)換。為了進一步提高信噪比，對于采集到的AD值，采用過采樣和中值平均濾波算法進行處理。對熒光和參考光，分別連續(xù)采集64次，從小到大依次排列，取出中間4個值，求平均。最后，將熒光和參考光的比值，作為輸入量送入由擬合得到的濃度計算公式，得到熒光物質(zhì)的濃度。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 熒光信號快速檢測系統(tǒng)對比測試和標定

采用文獻[9]所述方法，溶解4-MU并配置成1 mmol/L母液，避光保存。將母液進行梯度稀釋，并用所設(shè)計的熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)與Bio-tek公司所生產(chǎn)的多功能酶標儀Synergy HT對其最低熒光物質(zhì)檢測濃度進行對比測試和對比標定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 Synergy HT熒光值曲線和設(shè)計系統(tǒng)相對熒光值曲線

3.2 樣品測試和結(jié)果分析

利用自制實驗裝置連續(xù)20次測量空白溶液的相對熒光值，通過計算其標準偏差(SD)為0.001 235，平均值(M)為0.013 591，具有較好的重復(fù)性。另外，以M+3SD作為最低檢測限，則所設(shè)計的熒光物質(zhì)檢測系統(tǒng)的檢測限為0.017 296 μmol/L。

將1 mmol/L的4-MU母液進行不同比例的梯度稀釋，制成8個標準測試樣本，由標定好的熒光物質(zhì)檢測系統(tǒng)進行測試，測試結(jié)果如表1所示。

表1 熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)測試誤差對照表

從測試結(jié)果可以看出，所設(shè)計的熒光物質(zhì)檢測系統(tǒng)，與標準測試樣本的測試誤差均小于1.5 %，對于較低的0.031 25 μmol/L濃度的熒光物質(zhì)，仍然可以準確地檢測出。

實驗測量中，放入樣品后,0.5 s內(nèi)數(shù)據(jù)可達到穩(wěn)定，所以響應(yīng)時間小于0.5 s，滿足快速檢測的要求。

4 結(jié)束語

針對生化檢測和食品檢測中常見的熒光物質(zhì)4-MU的檢測問題，設(shè)計了一種基于LED激發(fā)光源調(diào)制和解調(diào)的熒光物質(zhì)快速檢測系統(tǒng)，并給出電路實現(xiàn)。為了驗證系統(tǒng)的性能，與多功能酶標儀進行了對比標定和測試，結(jié)果表明，所設(shè)計的系統(tǒng)線性度為0.997 9，檢測誤差小于1.5 %，響應(yīng)時間小于0.5 s，這對于食品和生化熒光快速檢測設(shè)備的開發(fā)，具有一定的參考意義。

[1] Mead J A R.The biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4-methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of beta-glucuronidase[J].Biochem J,1955,61:569-574.

[2] Van Tilbeurgh H.Fluorogenic and chromogenic glycosides as substrates and ligands of carbohydrases[J].Meth Enzymol,1988,160(part.A):45-59.

[3] Berg J D，F(xiàn)iksdal L.Rapid detection of total and fecal coliforms inwater by enzymatic hydrolysis of 4-methylumbelliferone-β-D-galactoside[J].Appl Environ Microbio，1988，54：2118-2122.

[4] Freydiere A，Gille Y.Detection of salmonellae by using Rambach prppyleneglycolcontaining agar for identification of salmonella spp[J].J Clin Microbiol，1991，29：2357-2359.

[5] Manafi M，Willinger B.Comparison of three rapid screening methods for identification of salmonella spp[J].Lett Appl Microbiol，1994，19：328-331.

[6] 蔡春林，周 新，易有榮，等.熒光分光光度法測定兒童血漿殼三糖苷酶活性的評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(11):1031-1034.

[7] 吳清平，馬延霞，張菊梅，等.香豆素類熒光底物的合成及其在微生物檢測中的應(yīng)用進展[J].化工進展,2014,33(9):2444-2449.

[8] 郭立泉，張玉鈞，殷高方,等.基于熒光壽命法的溶解氧檢測系統(tǒng)設(shè)計[J].傳感器與微系統(tǒng)，2011，30(10):109-111.

[9] Ziebold T.Precision and sensitivity in electron microprobe analysis[J].Anal Chem,1967,39:858-861.

Design of fluorescent substance rapid detection system based on LED excitation source*

GUO Li-quan1, YIN Huan-cai1,2, TIAN Jing-jing1,2

(1.Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology,Chinese Academy of Sciences,Suzhou 215163,China;2.Key Laboratory of Bio-Medical Diagnostics，Chinese Academy of Sciences,Suzhou 215163,China)

As a fluorescent substance,4-methylumbelliferone(4-MU)is widespread in food and biochemical tests.According to the detection of 4-MU,a fluorescent substance rapid detection method based on fluorescence analysis is proposed.LED as the excitation light source,a portable and high-sensitivity fluorescent substance rapid detection system is designed and realized.Comparison calibration and experiments are implemented between the system and multifunctional microplate reader.It is found that the linearity of the designed system is 0.997,and the detection error is less than 1.5 % and response time is less than 0.5 s.This research paves a reference for development of food and biochemical fluorescent substance tests device.

4-MU; fluorescent; fluorescent substance； rapid detection

10.13873/J.1000—9787(2017)05—0106—03

2016—06—10

江蘇省科技計劃資助項目(BY2014063，BY2015040—01，BY2015040—02)

Q 599

A

1000—9787(2017)05—0106—03

郭立泉(1983-),男，碩士，助理研究員，主要從事為醫(yī)用電子學(xué)系統(tǒng)設(shè)計。

尹煥才(1982-)，男，通訊作者，博士，副研究員，從事檢驗醫(yī)學(xué)儀器和體外診斷試劑方向研究工作，E—mail：yinhc@sibet.ac.cn。