趙雙雙，潘潔莉，劉 巧，蔣福升，陳 開，丁志山，李美芽*

(浙江中醫(yī)藥大學a.生命科學學院， b.分析測試中心，c.醫(yī)學技術(shù)學院，浙江 杭州 310053)

農(nóng)用真菌抑菌劑對白及種子萌發(fā)及小苗生長分化的影響

趙雙雙a，潘潔莉b，劉 巧c，蔣福升a，陳 開a，丁志山c，李美芽b*

(浙江中醫(yī)藥大學a.生命科學學院， b.分析測試中心，c.醫(yī)學技術(shù)學院，浙江 杭州 310053)

測定農(nóng)用真菌抑菌劑百菌清、多菌靈和代森錳鋅對白及組培中常見污染真菌的抑菌活性，同時探討這些抑菌劑對白及種子萌發(fā)和小苗分化生長的影響，以減少白及組培污染，提高組培效率。結(jié)果表明，3種抑菌劑對分離純化的6種白及常見污染真菌均具有較好的抑菌效果，其中多菌靈和代森錳鋅0.05%濃度可完全抑制真菌生長，但代森錳鋅對白及種子萌發(fā)和小苗生長毒性較大，不適宜作為組培添加劑；多菌靈0.05%以上濃度對白及小苗生長抑制較為明顯，但0.05%濃度對種子萌發(fā)影響較百菌清??；百菌清0.05%濃度對白及種子萌發(fā)影響相比多菌靈明顯，對小苗生長發(fā)育影響卻較小。進一步組培試驗表明，添加0.05%濃度的多菌靈可使白及種子母瓶污染率從30%降低至2%，抑菌效果明顯且不影響種子萌發(fā)。因此，0.05%多菌靈適合用于白及種子萌發(fā)，而0.05%百菌清適合用于后繼分化和生長育苗。

真菌抑菌劑； 白及； 萌發(fā)； 分化

中藥白及具有收斂止血，消腫生肌等功效[1]，長期以來主要靠采集野生資源供應市場需求，由于遭受破壞掠奪式采挖，目前野生資源匱乏，價格連年攀升，已超過800元·kg-1。為了解決這一藥用資源問題，課題組開展了白及組培快繁研究工作。前期研究發(fā)現(xiàn)，以白及果莢為材料進行組織培養(yǎng)，母瓶接種污染率有時高達30%以上，且多為真菌污染，這給組培生產(chǎn)帶來了極大浪費，也大大提高了生產(chǎn)成本。為了盡量降低組培成本，控制組培污染率提高生產(chǎn)效率是第一要務。一般企業(yè)要求污染率不高于5%，顯然，白及母瓶污染率非常之高，對產(chǎn)業(yè)化極為不利。因此，有必要采取合理措施，以有效降低污染率來提高生產(chǎn)效率。組培污染是相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)面臨的共性問題，為此已有不少學者通過在培養(yǎng)基中添加不同抑菌劑，來探討其降低組培污染率提高生產(chǎn)效率的可行性[2-4]，并取得了較為滿意的效果。鑒于白及組培主要是真菌污染，因此，本研究選用代森錳鋅、多菌靈和百菌清這3種常用農(nóng)用抑菌劑進行研究，探討其對白及常見污染真菌的抑制活性，同時分析其對白及種子萌發(fā)和小苗生長分化的影響，以便為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

超凈工作臺(上海比郎BL6-180A)，高壓滅菌鍋(日本Tomy)，電子天平(賽多利斯，BS110S)，恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅，HPX-9082)，PDA培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)，MS培養(yǎng)基(美國sigma公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 白及果莢消毒保存

白及果莢于2015年10月10日采自湖北省武穴市梅川鎮(zhèn)，經(jīng)75%乙醇消毒5 min，0.1%升汞消毒20 min，然后35 ℃干燥至種子水分含量在5%～10%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 白及種子母瓶接種培養(yǎng)及污染情況分析

取上述已消毒干燥處理過的果莢，無菌操作接種于MS液體培養(yǎng)基中，每顆種子接種3瓶，共接種198瓶，于25 ℃，3 000 lx光照下培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計污染率。

1.2.3 白及母瓶培養(yǎng)常見污染真菌分離培養(yǎng)

收集1.2.2中污染真菌，接種于PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃，90%濕度恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，并采用菌絲頂端純化法[5]分離、純化各污染真菌。

1.2.4 農(nóng)用抑菌劑對上述分離真菌抑制活性分析

向PDA培養(yǎng)基中加入不同濃度的農(nóng)用抑菌劑(百菌清、多菌靈和代森錳鋅)，配成系列固體培養(yǎng)基。采用切塊法接種上述分離真菌，置于28 ℃，90%濕度恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)9 d，測定直徑，分析各濃度抑菌劑對白及常見污染真菌抑制活性。

1.2.5 農(nóng)用抑菌劑對白及種子萌發(fā)影響

分別稱取各抑菌劑適量，分散于MS固體培養(yǎng)基中，配成含抑菌劑濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的4種濃度的處理組，每組重復3次，121 ℃高壓滅菌30 min備用。無菌操作接種白及種子，置于25 ℃，3 000 lx光照下培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計種子萌發(fā)情況，分析不同抑菌劑不同濃度對白及種子萌發(fā)的影響。

1.2.6 農(nóng)用抑菌劑對白及小苗分化、生長影響

分別稱取各抑菌劑適量，分散于MS固體培養(yǎng)基中，配成含抑菌劑濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的4種濃度處理組，每組3個重復，121 ℃高壓滅菌30 min備用。無菌操作接種已經(jīng)在MS培養(yǎng)基中萌發(fā)30 d的白及小種球，置于25 ℃，3 000 lx光照下培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12 h，繼續(xù)培養(yǎng)2個月后統(tǒng)計分析各抑菌劑對白及小苗分化、生長影響。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s)表示，利用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析處理，不同組間比較采用一維方差分析，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及種子母瓶接種污染率高

經(jīng)消毒處理的白及果莢接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計污染情況。由圖1可知，白及果莢經(jīng)上述消毒接種污染率較高，其中細菌污染率在4%左右，真菌污染率高達30%左右，且污染的真菌類型較多。有些真菌直接抑制白及種子萌發(fā)，有些種子雖能萌發(fā)，但很快褐化死亡，有些雖無明顯毒性，種子也能生長，但可能由于營養(yǎng)競爭而長勢較慢。白及果莢接種污染率高可能與白及果莢采集時間太晚、果莢開裂從而引發(fā)感染有關(guān)，也可能與其含有豐富的內(nèi)生菌有關(guān)[6]。

最后一張為正常無污染母瓶圖1 白及母瓶真菌污染情況

2.2 農(nóng)用抑菌劑對白及污染真菌抑制作用

通過PDA頂端純化法共分離純化上述白及常見污染真菌6株，切塊法接種于含有各抑菌劑的PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃，90%濕度恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)9 d，測定直徑，分析各抑菌劑對白及常見污染真菌抑制活性。從表1中可以看出，多菌靈與代森錳鋅對6株白及常見污染真菌抑制效果較好，在0.05%濃度下，只有6號菌株有一定生長，其他生長全部得到完全抑制；百菌清在0.1%濃度下，除4號菌株有一定生長外，其他全部得到完全抑制，0.05%濃度時大部分生長抑制也比較明顯；總體上4號和6號菌株耐藥性相對較強。

表1 不同抑菌劑濃度對6株白及常見污染真菌抑制活性的影響

2.3 農(nóng)用抑菌劑對白及種子萌發(fā)影響

抑菌劑在一定劑量范圍內(nèi)往往對植物體也有一定的生長抑制或毒性，因此必須對其安全性進行評價。本研究對各抑菌劑設立4個濃度梯度，探討其對白及種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的影響，以明確其在白及組培生產(chǎn)中的應用可行性。從圖2中可以看出，通過20 d培養(yǎng)，對照組萌發(fā)率高達95%以上，葉片舒展，根系生長明顯呈白色。百菌清0.05%濃度萌發(fā)率大于90%，少量萌發(fā)后變褐死亡，葉片明顯短小，根系沒有或變短，根基部變褐色，表現(xiàn)為生長抑制，而0.1%以上濃度種子基本萌動后全部死亡，可見百菌清對白及種子萌發(fā)毒性較大。多菌靈0.05%濃度萌發(fā)率基本和對照相當，葉片舒展，根系明顯，部分甚至長于對照組；0.1%濃度處理組萌發(fā)率大于90%，少量萌發(fā)后變褐死亡，葉片、根系明顯縮短，根開始變褐色，表現(xiàn)出一定的生長抑制作用；0.2%濃度處理組萌發(fā)率大于70%，萌發(fā)后變褐死亡明顯增多，葉片短小，大部分未長根，生長抑制顯著；0.4%濃度處理組全部死亡。代森錳鋅0.05%濃度處理組種子有萌動變綠色小球，但未見葉片根系等組織分化，部分開始變褐死亡，0.1%以上濃度全部死亡，對白及種子萌發(fā)表現(xiàn)為較大毒性作用?？梢姸嗑`對白及種子萌發(fā)毒性相對較低，結(jié)合前述各抑菌劑對白及常見污染菌株抑制活性，其較適合用于白及種子萌發(fā)添加抑菌劑，既可有效預防白及母瓶污染，又可確保種子正常萌發(fā)生長；而百菌清次之，濃度不應高于0.05%；代森錳鋅毒性較大，不適合白及組培應用。

A～F分別表示空白對照、百菌清0.05%、多菌靈0.05%、多菌靈0.1%、多菌靈0.2%、代森錳鋅0.05%圖2 不同濃度抑菌劑對白及種子萌發(fā)的影響

2.4 農(nóng)用抑菌劑對白及小苗分化、生長發(fā)育的影響

白及種子播種MS液體培養(yǎng)基，萌發(fā)培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)接到含系列濃度抑菌劑的MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2個月后統(tǒng)計各組白及小苗生長情況，結(jié)果如圖3和表2所示。對照組植株生長分化正常，平均株高在3.76 cm，根系和葉片較多，分別為5.55條和4.00片；除了含0.05%百菌清處理組株高和根數(shù)，0.1%百菌清和0.05%代森錳鋅處理組葉片數(shù)和對照組無顯著差異外，其他各處理組指標均表現(xiàn)出不同程度的生長抑制作用。含百菌清0.2%基本停止生長分化，0.4%全部褐化死亡；多菌靈各濃度雖都有一定生長分化，但隨濃度升高株高顯著變矮，葉片數(shù)變少，根系停止生長；代森錳鋅0.05%即對白及種子萌發(fā)完全抑制，但此濃度下白及小苗還能生長分化，但生長抑制現(xiàn)象明顯，而0.1%以上濃度全部褐化死亡，仍然表現(xiàn)出較大毒性?？梢姲倬鍖ΨN子萌發(fā)影響較大，但對應濃度對白及小苗生長分化影響較小，而多菌靈對白及種子萌發(fā)影響相對較小，但對應濃度對白及小苗生長抑制較百菌清明顯。因此，白及種子萌發(fā)母瓶適合選用多菌靈為抑菌劑，而小苗分化培養(yǎng)適合選用百菌清作為抑菌劑。

A～I分別表示空白對照組、百菌清0.05%、百菌清0.1%、百菌清0.2%、多菌靈0.05%、多菌靈0.1%、多菌靈0.2%、多菌靈0.4%和代森錳鋅0.05%圖3 各抑菌劑對白及小苗生長發(fā)育影響

組別株高/cm根數(shù)葉片數(shù)對照3.76±0.90e5.55±1.13d4.00±0.45d百菌清0.05%3.65±0.73e5.00±1.00d3.27±0.65ac百菌清0.1%2.48±0.38ab3.73±0.79a3.82±0.40d百菌清0.2%0.54±0.29f0e3.67±0.50dc多菌靈0.05%2.73±0.67a3.92±0.95a3.08±0.28abc多菌靈0.1%2.26±0.36b3.38±0.87ab3.15±0.38abc多菌靈0.2%1.59±0.39c2.58±1.08c2.92±0.29abc多菌靈0.4%1.05±0.22d2.54±0.66c2.85±0.55ab代森錳0.05%鋅2.29±0.90ab2.82±0.75bc3.73±0.47d

注：不同字母表示不同處理比較具有顯著性差異，P<0.05。

2.5 添加0.05%多菌靈對預防白及種子萌發(fā)污染效果

以MS為對照，配制含多菌靈0.05%的MS培養(yǎng)基，接種白及種子各100瓶，置于25 ℃，3 000 lx每天光照培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計污染率。結(jié)果表明，未加抑菌劑的MS培養(yǎng)基真菌污染率達25%，附加0.05%多菌靈后污染率僅為2%，起到了很好的預防作用。

3 討論

植物組培因其快繁、脫毒等眾多優(yōu)點已得到廣泛應用，但同時因其設備、人員操作、管理等要求較高，生產(chǎn)成本仍然較高。為此，不少學者采用培養(yǎng)基中添加抑菌劑的方式以便降低生產(chǎn)成本和提高生產(chǎn)效率，并已取得了良好效果，也由此產(chǎn)生了“開放式組培”這一新方法[7]。鑒于各抑菌劑在開放式組培中的成功應用，同時立足白及組培真菌污

染嚴重這一現(xiàn)實，本文開展了常用農(nóng)用真菌抑菌劑百菌清、多菌靈和代森錳鋅在白及組培污染防治應用的可行性研究。從上述結(jié)果看，代森錳鋅對白及組培常見污染真菌抑制效果較好，但其對白及種子萌發(fā)毒性較大，不適合做萌發(fā)抑菌添加劑，同時其對白及幼苗分化生長抑制明顯，因此也不適合做繼代幼苗添加劑。百菌清對白及種子萌發(fā)毒性也較大，0.1%濃度種子已全部死亡，而且0.05%濃度對白及常見真菌不能實現(xiàn)完全抑制，因此也不適合作為白及種子萌發(fā)抑菌添加劑。無論是對白及種子萌發(fā)還是幼苗生長分化，多菌靈均表現(xiàn)出較低毒性，但0.1%以上濃度生長分化抑制較為明顯。因此，綜合考慮0.05%多菌靈是白及種子萌發(fā)較為理想的抑菌添加劑，而且進一步試驗驗證其可使白及種子母瓶真菌污染率降低至2%，有效解決了白及母瓶污染這一主要問題。繼代育苗培養(yǎng)整體污染率較低，鑒于0.05%百菌清對白及小苗生長發(fā)育影響較小，可以考慮作為繼代育苗抑菌添加劑，以減少組培污染損失。此外，還應從源頭把關(guān)，合理優(yōu)化白及碩果采摘時間，以確保不因果莢開裂而增加污染機率。

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(責任編輯：張瑞麟)

2016-12-13

浙江省科技計劃項目(2015C32084)；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201507002)

趙雙雙(1996—)，生物科學專業(yè)，E-mail：zhaoss0814@163.com。

李美芽，E-mail: lmeiya@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170429

S318

A

0528-9017(2017)04-0638-04

文獻著錄格式：趙雙雙，潘潔莉，劉巧，等. 農(nóng)用真菌抑菌劑對白及種子萌發(fā)及小苗生長分化的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58(4)：638-641.