雷娟利，李必元，王五宏，岳智臣，陶 鵬，趙彥婷，鐘新民

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

大白菜葉柄黑點(diǎn)癥細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察

雷娟利，李必元，王五宏，岳智臣，陶 鵬，趙彥婷，鐘新民*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

通過(guò)光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)對(duì)大白菜葉柄黑點(diǎn)癥細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究。光學(xué)顯微鏡觀測(cè)結(jié)果表明，大白菜葉柄上的黑點(diǎn)少則由2～3個(gè)細(xì)胞、多則由20～30個(gè)細(xì)胞組成；電子顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生黑點(diǎn)癥的細(xì)胞細(xì)胞壁扭曲變形、葉泡和線粒體等細(xì)胞器降解破壞、多泡體形成、細(xì)胞核形狀發(fā)生改變、質(zhì)壁分離等典型的植物細(xì)胞程序化死亡的基本特征，由此推測(cè)，大白菜葉柄黑點(diǎn)癥是大白菜在受到過(guò)量氮肥等逆境條件下發(fā)生植物細(xì)胞程序性死亡的結(jié)果。

大白菜； 葉柄黑點(diǎn)癥； 顯微結(jié)構(gòu)； 細(xì)胞壁； 植物細(xì)胞程序性死亡

大白菜起源于中國(guó)，營(yíng)養(yǎng)較豐富(含有蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素和多種礦物質(zhì)及大量的膳食纖維)，具有悠久的栽培歷史，是歷代勞動(dòng)人民長(zhǎng)期培育出來(lái)的中國(guó)特產(chǎn)蔬菜。大白菜葉柄黑點(diǎn)癥嚴(yán)重影響大白菜的品質(zhì)，降低商品價(jià)值，給生產(chǎn)者、經(jīng)營(yíng)者和消費(fèi)者造成巨大損失。大白菜葉柄黑點(diǎn)癥是指大白菜結(jié)球葉葉柄表面發(fā)生的小黑點(diǎn)樣病變，這種小黑點(diǎn)樣病變可發(fā)生于葉柄內(nèi)外側(cè)，尤其以內(nèi)側(cè)表面更為嚴(yán)重，有時(shí)也可發(fā)生在葉脈處的內(nèi)外側(cè)表面。病斑主要集中在表皮層細(xì)胞，少有的也發(fā)生在葉肉細(xì)胞。病斑大小多為1～2 mm，有的病斑則需放大鏡才可見(jiàn)。病斑發(fā)展到后期，可使葉柄發(fā)生褐變及表皮開(kāi)裂以至腐爛。除生長(zhǎng)過(guò)程外，大白菜葉柄黑點(diǎn)癥在貯藏過(guò)程中還會(huì)加重，甚至在收獲時(shí)沒(méi)有病征的大白菜在貯運(yùn)中也能發(fā)生。另外，反季節(jié)栽培的大白菜，葉柄黑點(diǎn)癥發(fā)生更嚴(yán)重。楊曉云等[1-2]根據(jù)其表現(xiàn)特征及英文名稱稱之為“大白菜小黑點(diǎn)病”或“大白菜芝麻狀斑點(diǎn)病”。

引起大白菜葉柄黑點(diǎn)癥發(fā)生的機(jī)制尚不完全清楚。已有研究表明，大白菜葉柄黑點(diǎn)癥是一種生理性病害，為基因型和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，過(guò)量施用N肥是引起此癥的重要因素[3]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥也可影響大白菜葉柄黑點(diǎn)癥的發(fā)生[4]。到目前為止，未見(jiàn)有關(guān)對(duì)大白菜葉柄黑點(diǎn)癥開(kāi)展過(guò)細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察研究的相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)大白菜葉柄黑點(diǎn)癥細(xì)胞進(jìn)行了光學(xué)和電子顯微鏡的觀察研究，從細(xì)胞水平對(duì)大白菜葉柄黑點(diǎn)癥發(fā)生的機(jī)理進(jìn)行了探討，為大白菜葉柄黑點(diǎn)癥的發(fā)生機(jī)制研究及抗性育種工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為浙江省農(nóng)科院楊渡基地大白菜甘藍(lán)課題組的大白菜材料，取自2013春至2015年春，對(duì)其進(jìn)行葉柄黑點(diǎn)癥觀察、拍照，并取樣用于光學(xué)及電子顯微鏡觀察。

1.2 光學(xué)顯微鏡樣品制備與觀察

從田間取回的樣品，用自來(lái)水清洗，用吸水紙吸干凈水分，取有黑點(diǎn)癥狀的部分進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.3 透射電鏡樣品制備與觀察

將從田間取回的樣品用自來(lái)水清洗，用吸水紙吸干凈水分，包含黑點(diǎn)取0.1 cm×0.5 cm葉樣，迅速投入5%的戊二醛(0.1 mol·L-1PBS，pH值7.0配制)內(nèi)固定，抽氣直到材料下沉為止，于4 ℃冰箱中固定24 h，用0.1 mol·L-1PBS沖洗，而后用1%餓酸溶液固定4 h，再經(jīng)雙重蒸餾水沖洗，乙醇系列脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，徠卡公司UC6型超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸雙氧軸和檸檬酸鉛染色，于日立公司H-7650型透射電鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜葉柄黑點(diǎn)癥田間各種癥狀

大白菜葉柄黑點(diǎn)癥的典型癥狀是葉柄表面出現(xiàn)黑褐色的小點(diǎn)，黑點(diǎn)大小以1～2 mm較常見(jiàn)(圖1中A)，也有的黑點(diǎn)大小僅為0.1～0.5 mm，在葉柄表面呈又密又小淡黑色的一片(圖1中B)。黑點(diǎn)癥狀一般發(fā)生在葉柄內(nèi)表面，也經(jīng)常發(fā)生在葉柄的外表面或葉脈處(圖1中C)。黑點(diǎn)大多都發(fā)生在葉柄的表皮細(xì)胞，也有的發(fā)生在葉肉細(xì)胞(圖1中D)，在大白菜生長(zhǎng)后期，葉柄黑點(diǎn)癥常表現(xiàn)為葉柄發(fā)生褐變(圖1中E)、葉柄表皮開(kāi)裂(圖1中F)，甚至腐爛(圖1中G)。總之，葉柄黑點(diǎn)癥的癥狀有多種表現(xiàn)形式，因品種、環(huán)境因素及生育期的不同而異。

2.2 大白菜葉柄黑點(diǎn)癥細(xì)胞光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果

圖2看出，對(duì)大白菜葉柄黑點(diǎn)癥發(fā)病葉柄上的小黑點(diǎn)在光學(xué)顯微鏡下觀察可知，1～2 mm黑點(diǎn)通常發(fā)病細(xì)胞由幾十個(gè)細(xì)胞組成，整個(gè)細(xì)胞壁都有黑色物質(zhì)沉積，細(xì)胞內(nèi)也呈淡黑褐色，大液泡已遭破壞(圖2中A)。黑點(diǎn)又密又小的發(fā)病細(xì)胞僅為幾個(gè)，黑色物質(zhì)僅局限在邊角處，大液泡尚可見(jiàn)(圖2中B)。對(duì)葉肉細(xì)胞發(fā)病的黑點(diǎn)進(jìn)行觀察可知，表皮細(xì)胞大液泡清晰可見(jiàn)，黑色物質(zhì)在表皮下(圖2中C)。

A為大液泡已遭破壞，B為大液泡尚可見(jiàn)，C為黑色物質(zhì)在表皮下圖2 大白菜葉柄黑點(diǎn)癥細(xì)胞光學(xué)顯微鏡觀測(cè)結(jié)果

2.3 大白菜葉柄黑點(diǎn)癥電子顯微鏡觀察結(jié)果

如圖3中A～C為正常的大白菜葉柄表皮細(xì)胞，可看到細(xì)胞豐滿，大液泡幾乎充滿整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞器被擠到細(xì)胞壁附近薄薄的一層。放大可見(jiàn)細(xì)胞器完整，邊界清晰。圖3中D～L為發(fā)生黑點(diǎn)癥的細(xì)胞。從圖3中D可見(jiàn)，發(fā)病細(xì)胞細(xì)胞壁扭曲變形，細(xì)胞角質(zhì)層明顯增厚，扭曲變形處有黑色物質(zhì)，放大后由圖3(E～F)可見(jiàn)，有的細(xì)胞器外形已不可見(jiàn)，有的細(xì)胞器膜上則布滿小黑點(diǎn)。結(jié)果表明，黑點(diǎn)癥的細(xì)胞壁發(fā)生嚴(yán)重扭曲變形，內(nèi)部細(xì)胞器遭到嚴(yán)重破壞，細(xì)胞已死亡。

A～C為正常的大白菜葉柄表皮細(xì)胞，D為發(fā)病細(xì)胞，E～F有的細(xì)胞器外形已不可見(jiàn)，有的細(xì)胞器膜上則布滿小黑點(diǎn)，G為正在發(fā)病的細(xì)胞器，H為開(kāi)始發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞，J～K為細(xì)胞膜上形成的一個(gè)嵴狀結(jié)構(gòu)，L是一變形細(xì)胞核圖3 大白菜葉柄黑點(diǎn)癥細(xì)胞電子顯微鏡觀測(cè)結(jié)果

圖3中G顯示的是正在發(fā)病的細(xì)胞器，可見(jiàn)一個(gè)基本正常的細(xì)胞器，然后其他細(xì)胞器的膜上開(kāi)始出現(xiàn)黑色物質(zhì)，黑色物質(zhì)越來(lái)越多，細(xì)胞形狀逐漸消失?？梢?jiàn)液泡膜和細(xì)胞膜上也有黑色物質(zhì)沉積，部分液泡膜已遭到破壞。圖3中H顯示的是一個(gè)開(kāi)始發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞部分，細(xì)胞器受損變形，細(xì)胞膜也受損變形，且與細(xì)胞壁發(fā)生了分離。圖3中I顯示的是一個(gè)幾乎完整發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞，細(xì)胞壁已稍有變形。

圖3(J～K)顯示細(xì)胞膜上形成的一個(gè)嵴狀結(jié)構(gòu)，在一個(gè)基本正常的表皮細(xì)胞里由細(xì)胞膜處衍生出一個(gè)較大的嵴狀結(jié)構(gòu)(圖3中J)，放大后發(fā)現(xiàn)，是由一層層的膜構(gòu)成的，且中間膜較疏松，而外部的膜則較緊密(圖3中K)。這種嵴狀結(jié)構(gòu)一般在植物遇到逆境脅迫時(shí)出現(xiàn)，表明葉柄黑點(diǎn)癥的發(fā)生是受到某種逆境脅迫。

圖3中L是一個(gè)變形細(xì)胞核，細(xì)胞核不再是圓潤(rùn)的，而是皺縮的，且產(chǎn)生了許多指狀結(jié)構(gòu)，表明細(xì)胞核也受到了破壞。

3 小結(jié)與討論

大白菜葉柄黑點(diǎn)癥是一種生理性病害，過(guò)量施用N肥是本病加重的一個(gè)重要因素。劉東等[4]開(kāi)展了氮素濃度對(duì)大白菜小黑點(diǎn)病發(fā)生的影響，結(jié)果均表明，氮濃度對(duì)感病品系03B9和P8-2的細(xì)胞膜透性和 MDA 含量的影響比抗病品系C24和P8-1大，推測(cè)感病品系細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使細(xì)胞膜透性增大并發(fā)生脂膜過(guò)氧化反應(yīng)，表現(xiàn)出電導(dǎo)率增大及MDA含量的升高，這可能是小黑點(diǎn)發(fā)生的原因。在本研究中，通過(guò)電子顯微鏡觀察結(jié)果證實(shí)了這一推測(cè)，在多張不同的照片中顯示了細(xì)胞器膜，液泡膜及細(xì)胞膜遭到了破壞。而發(fā)展的過(guò)程是先有黑色物質(zhì)在細(xì)胞膜上沉積，隨著黑色物質(zhì)的增加，細(xì)胞膜逐漸受到降解破壞。這表明大白菜葉柄黑點(diǎn)癥的發(fā)生與細(xì)胞膜受損有關(guān)。

植物細(xì)胞程序性死亡(programmmed cell death，PCD)普遍存在于植物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，是由特定基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的現(xiàn)象。植物細(xì)胞程序性死亡不僅對(duì)正常植物的生長(zhǎng)發(fā)育是必不可少的，而且在抵御病原體入侵及植物響應(yīng)非生物環(huán)境脅迫過(guò)程中也起著重要的作用[5]。本研究中發(fā)現(xiàn)了許多現(xiàn)象，如細(xì)胞壁的扭曲變形、細(xì)胞核畸形、多泡體出現(xiàn)、細(xì)胞質(zhì)壁分離等都是典型的植物細(xì)胞程序性死亡的基本特征。因此，大白菜葉柄黑點(diǎn)癥也可能是大白菜在過(guò)量氮肥等逆境條件下的植物細(xì)胞程序化死亡的結(jié)果。

細(xì)胞壁扭曲變形是引起大白菜葉柄黑點(diǎn)癥發(fā)展后期表皮開(kāi)裂的主要原因，由于表皮層開(kāi)裂，使內(nèi)部細(xì)胞失去保護(hù)，導(dǎo)致病原微生物進(jìn)入，進(jìn)而引起葉柄腐爛。

[1] 楊曉云，張淑霞，張清霞，等. 氮肥對(duì)大白菜生理障害——小黑點(diǎn)病發(fā)生影響的初步研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21(增刊)：151-153.

[2] 郭瑩，楊曉云，司朝光，等. 不同形態(tài)氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)大白菜芝麻狀斑點(diǎn)病發(fā)生的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38(8)：1489-1497.

[3] 雷娟利，鐘新民，李必元，等．有機(jī)肥對(duì)大白菜葉柄黑點(diǎn)癥及葉緣黑點(diǎn)癥的影響[J]．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56(10)：1593-1597.

[4] 劉東，楊曉云，王媛，等. 氮素濃度對(duì)大白菜小黑點(diǎn)病發(fā)生的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(11)：303-307.

[5] 李云霞，程曉霞，代小梅，等. 植物在逆境脅迫中的細(xì)胞程序性死亡[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2009(4)：7-11.

(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-01-18

浙江省自然科學(xué)基金(LY14C150003)；浙江省重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“園藝作物育種技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”項(xiàng)目(2013TD05)

雷娟利(1971—)，副研究員，博士，從事白菜抗病育種研究工作，E-mail: juanlil@126.com。

鐘新民，研究員，E-mail:zxmlly@hotmail.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170443

S436.5

A

0528-9017(2017)04-0688-03

文獻(xiàn)著錄格式：雷娟利，李必元，王五宏，等. 大白菜葉柄黑點(diǎn)癥細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(4)：688-690，694.