瑪依拉·吐爾遜+阿加爾·木合大+薩努巴兒·買買提+吐爾遜·沙比爾

[摘要] 目的 探討大鼠腦梗死后功能恢復過程中神經生長抑制因子Nogo-A的表達水平。 方法 選取雄性SD大鼠60只，采用隨機數字表法分為對照組和模型組，每組各30只。模型組制備MCAO模型，對照組行假手術處理，各組于術后第3、7、28天三個時間點隨機取10只進行檢測，原位雜交法和Western blot法檢測Nogo-A mRNA和蛋白表達，采用Longa評分標準對神經功能評分，HE染色觀察分析神經元形態(tài)。 結果 模型組術后Nogo-A mRNA和蛋白表達明顯高于對照組（P < 0.05）；模型組術后第7天Nogo-A mRNA和蛋白表達量明顯高于術后第3、28天（P < 0.05），而術后第28天明顯低于術后第3天（P < 0.05）；HE染色顯示，對照組神經元形態(tài)正常，模型組神經元形態(tài)異常，其中模型組第7天細胞形態(tài)、梗死狀況及周圍炎性反應較第3、28天重；模型組術后神經功能評分明顯高于對照組（P < 0.05）；模型組術后第28天神經功能評分明顯低于術后第3、7天（P < 0.05）。 結論 大鼠腦梗死后Nogo-A表達明顯升高，可能與損傷后神經再生障礙有關。

[關鍵詞] 腦梗死；Nogo-A；MCAO模型；大鼠

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（b）-0016-04

Action mechanism of neuronal inhibitory factor Nogo-A on rats in functional recovery after cerebral infarction

Mayila·Tuerxun1 Ajiaer·Muheda1 Sanubaer·Maimaiti2 Tuerxun·Shabier1

1.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830054， China； 2.Department of Neurology， the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To discuss Nogo-A expression of nerve growth inhibitor in cerebral infarction rats during functional recovery. Methods 60 male SD rats were randomly divided into two groups： control group and model group by random number table method， 30 rats in each group. The model group were prepared with MCAO model， and the control group were treated with sham operation. 10 rats were randomly chosen to tested from each group in postoperative 3， 7， 28 d. Neuronal morphology was observed by using HE staining， and the Nogo-A mRNA and protein expression were tested in situ hybridization and Western blot method， Longa score standard were used to scored nerve function. Results Nogo-A mRNA and protein expression in model group was significantly higher than that in control group （P < 0.05）. Nogo-A mRNA and protein expression in postoperative 7 d of model group were significantly higher than that in postoperative 3， 28 d （P < 0.05）. Nogo-A mRNA and protein expression in postoperative 28 d were significantly lower than that in postoperative 3 d （P < 0.05）. HE staining showed normal morphology of neurons in control group and abnormal morphology of neurons in model group， and the cell morphology， myocardial infarction and peripheral inflammatory response in model group of 7 days were more serious than 3， 28 d. The neurological function scores in model group was significantly higher than that in control group （P < 0.05）. The neurological function score in postoperative 28 d was significantly lower than that in postoperative 3， 7 d （P < 0.05）. Conclusion Nogo-A expression significantly increase in cerebral infarction in rats， which may be related to the nerve regeneration disorders after injury.

[Key words] Cerebral infarction； Nogo-A； MCAO model； Rat

腦梗死是一種由多因素作用引起的腦部缺血、缺氧進而誘發(fā)的局限性腦組織缺血性壞死或軟化疾病。本病存在明顯高危特征，具有極高致死和致殘率，嚴重威脅人類安全[1-3]。腦梗死發(fā)病后患者神經系統(tǒng)存在明顯損傷，并且介入治療后恢復難度也較大，其原因可能為：①患者中樞神經系統(tǒng)內在特性損傷，缺乏再生能力；②中樞神經系統(tǒng)內某些物質抑制而出現再生功能損傷[4]。目前，臨床認為第二種因素是腦梗死神經系統(tǒng)損傷的主要原因，并且認為神經生長抑制因子Nogo-A在其中扮演著重要角色[5]。本研究選取雄性SD大鼠30只進行MCAO造模研究，旨在分析神經生長抑制因子Nogo-A在腦梗死中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

選取雄性清潔級SD大鼠60只，體重（300±20）g，6～8周齡，大鼠購自于新疆醫(yī)科大學（動物合格證號編號XJYKDX-20151211007）。采用隨機數字表法分為對照組和模型組，每組各30只，各組于術后第3、7、28天三個時間點各取10只進行取材。實驗過程中動物飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關規(guī)定并得到新疆醫(yī)科大學動物實驗中心的批準。

完全蛋白酶抑制劑由Sigma公司生產（Sigma-P-4265）；Nogo-A兔多克隆抗體由武漢博士德公司生產（BSD-1502）；Western免疫印跡化學發(fā)光試劑盒由北京科美生物技術有限公司生產。熒光倒置顯微鏡由日本Olympus公司生產；FACSAria流失細胞儀由美國BD公司生產；凝膠圖像分析儀由日本Kodak公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 模型組MCAO模型制備方法如下：給予大鼠腹腔麻醉后，頸部備皮，消毒，縱切口暴露頸動脈，結扎頸外動脈、頸總動脈，動脈夾鉗夾頸內動脈。于頸總動脈做0.5 mm切口，將肝素消毒尼龍線置入頸總動脈切口內，并插入至頸內動脈10 mm，阻斷大鼠大腦動脈，結扎頸總動脈線，縫合皮膚。對照組單純縱切口暴露頸動脈，然后縫合，行假手術；模型組腦組織的TTC染色見圖1（染色成功即代表造模成功）。

1.2.2 原位雜交實驗 術后24 h處死大鼠，開顱取出梗死腦組織，固定切片，滴入15 g/L聚乙烯吡咯烷+15 g/L葡聚糖+0.05 mmol/L氯化鈉+450 g/L甲酰胺+80 g/L硫酸葡聚糖進行預雜交，振蕩均勻后于室溫環(huán)境下孵化2 h，滴入1.5 mol/L地高辛標記Nogo-A，同時加入0.05 mg/L蛋白酶K+0.8 mmol/L EDTA進行雜交，振蕩均勻后，室溫下孵化60 min，而后選用高辛顯色，脫水，中性樹膠封片，同時進行相同原點雜交操作。

1.2.3 Nogo-A蛋白檢測 將梗死腦組織切碎后置入玻璃管內研碎，懸液3000 r/min離心，取上清，加入上樣緩沖液，煮沸，5000 r/min，3 cm半徑離心10 min，取上清，置入SDS-聚丙烯酞胺凝膠孔內，常規(guī)電泳，而后將樣本放置于PVDF膜上，封閉60 min，加入10 mL 0.5% Nogo-A兔多克隆體進行一抗，孵化1 h，室溫搖床50 r/min，TBST洗膜2次，每次10 min，加入0.5%封閉稀釋液二抗，孵化1 h，室溫搖床50 r/min，TBST洗膜2次，每次10 min，化學發(fā)光法顯示，選用去離子水漂洗纖維膜，濾紙吸干，將膜貼于發(fā)光液上，孵化2min后送入X-光片盒內，于暗室內X線片顯影，檢測儀器選用KONTROMBAS 2.0全自動圖像分析儀。

1.2.4 HE染色 梗死腦組織切片后進行常規(guī)包埋，5 μm切片，置于pH 6.0的檸檬酸抗原中修復，洗滌2次，加入50 μL 5%過氧化氫孵化30 min，滴入50 μL羊血清封閉20 min，加入50 μL Nogo-A兔多克隆體（1∶500）進行一抗，4℃冷藏過夜，取出待其正?；販睾笙礈?次，滴入50 μL兔多克隆抗NgR抗體進行二抗，室溫下孵化40 min，洗滌2次，吸取周圍水分，滴入30 μL辣根酶標記卵霉鏈白素，室溫孵化30 min，洗滌2次，吸取水分，BAD顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，鏡檢。對切片反應產物陽性信號進行檢測，即根據檢測區(qū)域的灰度級、面積以及陽性反應產物灰度級、面積計算陽性單位值（PU）。

1.2.5 神經功能評定 根據Longa評分標準進行[6]：大鼠蘇醒1 h后，無神經損傷0分；側肢彎曲、內收或伴霍納征為1分；行走向對側畫圈為2分；行走向對側傾倒為3分；無法行走或伴意識障礙為4分。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組Nogo-A mRNA表達量比較

模型組術后第3、7、28天Nogo-A mRNA表達量明顯高于對照組（P < 0.05）；模型組術后第7天Nogo-A mRNA表達量明顯高于術后第3、28天（P < 0.05），而術后第28天明顯低于術后第3天（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組Nogo-A蛋白表達量比較

模型組術后Nogo-A蛋白表達量明顯高于對照組（P < 0.05）；模型組術后第7天Nogo-A蛋白表達量明顯高于術后第3、28天（P < 0.05），而術后第28天明顯低于術后第3天（P < 0.05）。見表2、圖2。

2.3 HE染色圖像分析

HE染色顯示，對照組神經元形態(tài)正常，核仁清晰，神經細胞數量多且排列整齊。模型組神經元體積明顯減小，形態(tài)呈多角形或扇形，其中模型組第7天細胞形態(tài)和梗死狀況及周圍炎性反應較第3、28天重。見圖3。

2.4 兩組神經功能評分比較

模型組術后第3、7、28天神經功能評分明顯高于對照組（P < 0.05）；模型組術后第28天神經功能評分明顯低于術后第3、7天（P < 0.05）。見表3。

3 討論

腦梗死發(fā)病后，患者病灶區(qū)域腦組織神經細胞微環(huán)境存在明顯改變，大量的促突觸再生相關神經營養(yǎng)因子，以及軸突再生相關抑制因子被合成，參與患者中樞神經損傷的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。臨床研究認為，如無法解除這些相關神經細胞因子異常表達情況，中樞神經系統(tǒng)的再生功能將無法恢復至正常水平[9]。

神經生長抑制因子Nogo-A是目前發(fā)現的最具有代表性的神經纖維再生抑制因子[10-11]。Nogo-A屬于網狀蛋白質家族，主要分布于中樞神經系統(tǒng)少突膠質細胞內，可與高爾基體及內質網相互作用[12]。Nogo-A具有188個氨基羧基末端，并且66個氨基酸殘基構成了Nogo-66。Nogo-66位于Nogo-A細胞表面，其對神經元具有特異性作用，可抑制神經軸突生長[13]。腦梗死發(fā)病后，患者梗阻區(qū)域內的Nogo-A可與其受體NgR相互作用，并激活RhoA信號路徑，促進這一區(qū)域內的生長錐萎縮，進而抑制神經再生[14-15]。

NgR作為Nogo-A的受體，是一種糖基脂酰肌醇（GPI）結合細胞表面蛋白，主要分布于灰質、腦橋以及海馬等區(qū)域，其可與Nogo-A細胞表面的GPI偶聯蛋白相互作用，并介導Nogo-66的神經軸突生長抑制效應[16-17]。本次研究中，模型組術后Nogo-A mRNA和蛋白表達明顯高于對照組；模型組術后第7天Nogo-A mRNA和蛋白表達量為16.01±0.94和4.27±0.95，明顯高于術后第3、28天，而術后第28天為12.14±1.20和1.05±0.73，明顯低于術后第3天，提示MCAO造模后大鼠存在明顯的腦梗死癥狀，其腦神經功能損傷明顯。分析大鼠造模術后Nogo-A mRNA和蛋白表達量第7天高于第3、28天及第28天低于第3天的原因可能與第7天大鼠腦缺血后再灌注損傷及損傷組織代償應激反應到達峰值有關，并且這種應激反應在第7天后逐步降低，到了第28天應激反應達到最低谷，故大鼠第28天的Nogo-A mRNA和蛋白表達量明顯低于第3天。

本次研究中，HE染色顯示，對照組神經元形態(tài)正常，核仁清晰，神經細胞數量多且排列整齊。模型組神經元腫脹，體積增大，形態(tài)呈多角形或扇形，模型組第7天細胞形態(tài)和梗死狀況，及周圍炎性反應較第3、28天重，這也可能與再灌注損傷有關。已有研究證實，危重病性多發(fā)性神經病的神經保護作用存在快速相和延遲相兩個保護期，快速相即發(fā)生于缺血即刻，通常持續(xù)1～2 h；延遲相則出現在發(fā)病1 d后，并在3～7 d達到高峰[18]。本次研究中，大鼠預計再灌注時間為3 d，此時大鼠腦應激反應最為強烈。因此，對比兩組大鼠神經功能評分可知，模型組術后神經功能評分明顯高于對照組；并且模型組術后第28天神經功能評分為（1.30±0.84）分，明顯低于術后第3、7天。術后第3、7天大鼠神經功能評分相對較高的原因可能與再灌注誘導的缺血耐受機制有關。

有學者[19-20]在大鼠實驗中，對大鼠大腦皮質進行了高壓氧預處理發(fā)現，大鼠大腦皮質內的Nogo-A表達明顯降低，該學者分析認為對腦缺血進行預處理后，大鼠神經損傷可顯著下降，這將是腦缺血相關疾病治療的重要研究方向。綜上所述，大鼠MCAO腦梗死造模后Nogo-A表達明顯升高，大鼠神經功能評分顯著下降，其機制可能與Nogo-A介導Nogo-66的神經軸突生長抑制效應，導致腦組織神經再生障礙有關。

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