董月柳+劉洋+尹秀文+潘孟+李雪蓮+王子禹+董玲

[摘要] 對基于P-糖蛋白（P-gp）腸吸收單灌流模型進行驗證。首先，通過酚紅灌流，采用質量法進行水分校正，通過高效液相色譜法對灌流前后酚紅水平進行檢測，以驗證腸上皮細胞的緊密連接結構正常，且腸上皮的完整性保持良好；其次，采用FDA指定陽性藥地高辛對模型進行驗證，給予大鼠不同質量濃度維拉帕米后，對大鼠回腸段地高辛吸收參數(shù)進行觀察對比。酚紅在大鼠體內回腸段存在吸收，吸收參數(shù)有效滲透系數(shù)Peff為（1.09±0.62）×10-6 cm·s-1，結果表明腸上皮細胞的緊密連接結構正常，且腸上皮的完整性保持良好，地高辛灌流不給予維拉帕米時，地高辛在回腸段存在一定程度的吸收，吸收參數(shù)有效滲透系數(shù)Peff為（1.07±0.59）×10-5 cm·s-1，給予大鼠0.01，0.1 mmol·L-1濃度的維拉帕米后，地高辛在大鼠回腸的吸收呈上升趨勢，吸收參數(shù)有效滲透系數(shù)Peff分別為（1.58±0.69）×10-5，（3.28±0.95）×10-5 cm·s-1，高濃度時，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。地高辛灌流實驗驗證了小腸上皮P-gp表達完整，可以用于P-gp外排轉運體的研究。

[關鍵詞] 在體單向腸灌流模型；酚紅；地高辛；P-gp

Validation of in situ single pass perfusion model based on P-gp

DONG Yue-liu， LIU Yang， YIN Xiu-wen， PAN Meng， LI Xue-lian， WANG Zi-yu， DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To validate in situ rats intestinal single pass perfusion model based on P-glycoprotein （P-gp）. Firstly， phenol red perfusion was carried out to verify the close connection structure of intestinal epithelial cells， and the integrity of the intestinal epithelium， with a gravimetric method for correcting water flux. The level of phenol red was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） both before and after perfusion. Secondly， the positive drug digoxin specified by FDA was used to validate the model. After different mass concentrations of verapamil were given in the rats， the absorption parameters of digoxin in ileum of rats were observed and compared. The results showed that the phenol red was absorbed in rats ileum segment， with an effective permeability coefficient of （1.09±0.62）×10-6 cm·s-1. The experiment results indicated that the close connection structure of intestinal epithelial cells was normal， and the integrity of the intestinal epithelium was maintained well. In digoxin perfusion experiment， in case no verapamil was given， digoxin showed certain degree of absorption in rat ileum， with an effective permeability coefficient （Peff） of （1.07±0.59）×10-5 cm·s-1； after mass concentrations of 0.01，0.1 mmol·L-1 verapamil were given， the absorption of digoxin was on the rise in rat ileum， with an effective permeability coefficient Peff of （1.58±0.69）×10-5， （3.28±0.95）×10-5 cm·s-1 respectively （P<0.05）. Digoxin perfusion experiment verified that P-gp expression in small intestine epithelium was intact and can be used in the research of P-gp efflux transporter.

[Key words] in situ rat intestinal perfusion； phenol red； digoxin； P-gp

口服是用藥方式最常見的，因為它具有方便、安全、低成本和患者依從性的特點[1]?？诜杖Q于藥物從劑型中釋放和在腸膜的滲透，所以藥物的溶解和滲透過程是藥物吸收最基本的條件[2]。基于此理論，Amidon等[3]提出了生物藥劑學分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS），根據(jù)藥物的溶解度和滲透性高低將藥物分為四類。2000年美國 FDA頒布BCS作為1種科學方法用于速釋固體口服劑型Ⅰ類（高溶解度和高滲透性）的體內生物利用度豁免和生物等效性試驗[4]，以此科學框架制訂了藥品生物等效豁免的相關技術要求，即對于BCSⅠ類的藥品上市后的變更、仿制給予免除生物等效性研究的支持。隨著BCS的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)其對已上市藥品生物利用度的認識具有重要價值，從而繼續(xù)前移到藥品開發(fā)甚至前體藥物篩選，將BCS推至口服藥物成藥性論證的核心地位，通過制劑手段改變藥物的BCS分類也成為生物藥劑學研究和新劑型研究的重要目標之一。BCS是基于化學藥物提出來的，而中藥具有多成分的特點，這就決定了研究中藥的滲透性和溶解度時要考慮它所處的多成分環(huán)境，因此本課題組借鑒化學藥物BCS的優(yōu)勢結合中藥多成分的特點，提出了中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)[5]，課題組前期通過單成分到兩成分再到多成分配伍逐漸遞增的思路對葛根芩連方中的高含量成分葛根素和小檗堿在多成分環(huán)境中的滲透性和溶解度進行研究，研究結果顯示，成分與成分之間存在相互作用[6-8]，這種相互作用引起藥物的腸滲透性的改變。藥物的主要吸收部位是小腸，藥物在小腸吸收的同時發(fā)生著多種過程[9]，在人體中低滲透的藥物可能是膜上的外排轉運體將藥物外排引起的，例如P-gp。研究滲透性的模型，美國FDA推薦使用動物的體內、在體灌流模型或體外模型（切除的腸組織或者合適的上皮細胞單層膜）[10-11]，通常使用Caco-2細胞模型。然而當外排蛋白在研究模型上存在缺陷或者表達的程度低于人體時，存在外排轉運的藥物比被動轉運的藥物更容易出現(xiàn)錯誤的滲透性分類[12]，相關研究結果也顯示，F(xiàn)DA中BCS的指導原則中體外細胞滲透模型不能準確預測藥物在人體的吸收程度[13-14]，所以選擇合適的模型研究藥物的轉運機制至關重要。本課題通過酚紅和地高辛灌流實驗分別對與人體相似性大的在體單向腸灌流模型的腸上皮細胞的緊密連接結構以及P-gp表達完整性進行驗證，有利于更好地為藥物進行正確的BCS分類提供條件。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A型紫外檢測器，SIL-20A自動進樣器，日本島津公司）；BT-25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER2100實驗室pH計（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 試劑與藥品

酚紅對照品（批號P0882-25G，上海百賽生物技術有限公司），地高辛對照品（批號20140316，南通飛宇生物科技有限公司），乙腈（色譜級，美國Fisher公司），娃哈哈純凈水購買于娃哈哈集團公司（中國杭州），其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，體重200～220 g，斯貝福（北京）實驗動物技術有限公司提供，許可證號 SCXK（京）2011-0004。

2 方法

2.1 供試液的配制

2.1.1 Krebs-Ringer′s營養(yǎng)液（K-R液）配制

稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去離子水定容至1 000 mL，即得，加入NaHCO3，調節(jié)pH為7.4。

2.1.2 酚紅對照品儲備液制備

精密稱定酚紅0.1 g置于50 mL量瓶中，用K-R液定容，得2 g·L-1的酚紅母液。

2.1.3 酚紅灌流液制備

取2.0 mL母液置于200 mL量瓶中，K-R液稀釋并定容得20 mg·L-1的酚紅溶液。

2.1.4 地高辛母液制備

精密稱定地高辛對照品5 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得100 mg·L-1的地高辛母液。

2.1.5 地高辛灌流液制備

取地高辛母液5 mL，置于100 mL量瓶中，用K-R液定容，得5 mg·L-1的地高辛灌流液。

2.2 含量測定方法

2.2.1 酚紅含量測定方法

2.2.1.1 酚紅色譜條件 GEMINI C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Phenomenex），流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，流動相0.1%磷酸（A）-乙腈（B）（68∶32），等度洗脫。

2.2.1.2 標準曲線制備 精密吸取酚紅對照品儲備液，以適量的K-R 緩沖液 （pH 7.4） 將其分別稀釋為2.5，5，10，20，40，80 mg·L-1，進樣20 μL，以質量濃度（X，mg·L-1），對峰面積 （Y） 進行線性回歸，得標準曲線方程。

2.2.1.3 回收率 用空白腸灌流液配制低、中、高 （2.5，20，80 mg·L-1） 3個濃度的酚紅溶液，分別進樣，測定峰面積，考察酚紅的回收率。

2.2.1.4 精密度 取酚紅對照品溶液連續(xù)進樣6次，測定酚紅峰面積。

2.2.1.5 重復性 取低、中、高3個對照品濃度依次進樣3次，測定酚紅峰面積。

2.2.1.6 穩(wěn)定性 取酚紅供試品高、中、低3個濃度，將供試品溶液置于37 ℃的水浴中3 h，按上述液相色譜條件測定峰面積。

2.2.2 地高辛含量測定

2.2.2.1 地高辛色譜條件 GEMINI C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Phenomenex），流動相1% 冰醋酸（A）-乙腈（B）（68∶32），等度洗脫，檢測波長230 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，進樣量20 μL。

2.2.2.2 標準曲線制備 精密吸取地高辛對照品貯備液5 mL置于10 mL量瓶中，加入5 mL K-R 液，將其分別稀釋為質量濃度為3.125，6.25，12.5，25，50 mg·L-1系列溶液。以地高辛濃度（X） 對峰面積（Y） 繪制標準曲線，進行線性回歸。

2.2.2.3 回收率 用空白腸灌流液配制低、中、高 （2.5，20，80 mg·L-1） 3個濃度的地高辛溶液，分別進樣，測定峰面積，考察地高辛的回收率。

2.2.2.4 重復性 取低、中、高3個對照品濃度依次進樣3次，測定地高辛峰面積。

2.2.2.5 精密度 取地高辛對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定地高辛峰面積。

2.2.2.6 穩(wěn)定性 取地高辛母液1 mL置于20 mL量瓶中，K-R液稀釋并定容得5 mg·L-1的灌流液，將灌流液置于37 ℃的水浴中3 h，按上述液相色譜條件測定峰面積。

2.3 大鼠在體腸吸收試驗

大鼠禁食不禁水18 h，水合氯醛麻醉后固定于手術臺，沿腹中線剪開腹部3～4 cm，找到實驗用腸段（十二指腸段自幽門1 cm處開始，空腸段自幽門15 cm處開始，回腸段自盲腸上行20 cm處開始，小腸自幽門1 cm 處開始至盲腸前端結束，結腸段從盲腸后端開始）取10 cm，在所取腸段兩端剪一小口，插入塑料管，用絲線固定。生理鹽水沖洗腸內容物，在腸端連接注射泵以0.5 mL·min-1 灌流藥液，約30 min吸收穩(wěn)定后，開始計時，用已知質量的小瓶在出口處每隔15 min收集1次，作為1個取樣點，同時用下1個已知質量的小瓶替換，收集8次后完畢，計算收集前后小瓶質量稱量差，測定收集液中藥物濃度。實驗結束后處死大鼠，用生理鹽水沖洗，并剪下被灌流的腸段，測量其長度和內徑。計算公式如下[15]。

Peff=-Qin·ln（Cout（cor）/Cin）2πrL

Ka=（1-Cout（cor）Cin）QinV

Fa=（1-Cout（cor）Cin）×100%

Cout（cor）=CoutQoutQin

Qout=Mout/Doutt

Qin為灌流液流速（mL·min-1）；L為灌流腸段長度（cm）；r為灌流腸段半徑（cm）；Cin為灌流液初始濃度（mg·L-1）；Cout（cor）為經質量法校正后的灌流收集液濃度（mg·L-1）；V=πr2L為灌流腸道體積（mL）；Qout為通過灌流液密度測定的流出流速（mL·min-1）；Cout為灌流收集液質量濃度（mg·L-1）；Mout為灌流收集液質量（g），Dout為灌流收集液密度（g·mL-1），t為取樣周期（min）。

吸收參數(shù)結果以±s表示，用統(tǒng)計分析軟件SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗分析，當P<0.05 時判定具有顯著性差異。

3 結果

3.1 酚紅藥物濃度的測定

分別取空白灌流液、對照品溶液、含藥灌流液進行液相檢測，考察該色譜條件下空白灌流液對樣品含量測定的干擾，結果見圖1，在2.2.1.1色譜條件下，空白灌流液對樣品含量測定無干擾，說明該方法的專屬性良好，酚紅的線性回歸方程為Y=15 838X+3 367.9，R2=0.999 8，結果表明酚紅在2.5～80 mg·L-1線性良好，測得的酚紅的回收率為95.60%～103.4%，精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗RSD均小于1%。

酚紅腸吸收參數(shù)的計算結果（±s，n=3）有效滲透系數(shù)Peff為（1.09±0.62）×10-6 cm·s-1，吸收速率常數(shù)Ka為（1.19±6.7）×10-5 s-1，吸收分數(shù)Fa為（0.33±0.087）%，從結果可知，酚紅為低滲透性藥物，與文獻報道相符[16-17]，說明腸上皮細胞的緊密連接結構正常，且腸上皮的完整性保持良好。

3.2 地高辛濃度測定

分別取空白灌流液、含藥灌流液進行液相檢測，考察該色譜條件下空白灌流液對樣品含量測定的干擾，結果見圖2，在1色譜條件下，空白灌流液對樣品含量測定無干擾，說明該方法的專屬性良好，地高辛的線性回歸方程為Y=15 363X-2 499.7，r=0.999 1，地高辛在3.125～50 mg·L-1線性關系良好。高、中、低3個濃度的平均回收率95.56%～105.2%，精密度、重復性試驗RSD均小于1%，穩(wěn)定性試驗小于2%。

當加入0.01 mmol·L-1維拉帕米時，對P-gp的抑制微弱，統(tǒng)計學顯示P>0.05，差異不顯著；給予0.1 mmol·L-1維拉帕米時，統(tǒng)計結果顯示P<0.05，具有顯著性差異，說明維拉帕米對P-gp的抑制程度與其濃度有關，不同濃度的維拉帕米對回腸段的P-gp抑制作用，隨著濃度的增大而增強，見表1。實驗結果表明P-gp在小腸的表達完整，模型具有可行性。

4 討論

研究藥物口服吸收的常用模型分為在體、離體和Caco-2細胞模型[18]。Caco-2細胞模型具有以下優(yōu)點[19]：①研究藥物從小腸吸收以往主要考慮的是從腸腔一側（AP側，apical side）攝入，實際上，藥物從腸道進入循環(huán)系統(tǒng)，包括AP側攝入和從腸壁一側BL側，（basolateral side）外排2個過程同時進行，用Caco-2細胞模型可以分別研究藥物從AP側的攝入，在細胞中的停留代謝及BL側的外排等過程，因此對闡明藥物在小腸中的吸收機制是十分有用的，動物實驗則無法做到這些；②條件容易控制，數(shù)據(jù)重復性好；③與動物實驗相比，更省時和經濟。盡管Caco-2細胞模型在評價口服藥物吸收方面有諸多的優(yōu)點，但是也具有明顯的不足[20]：①Caco-2是以結腸細胞系為基礎分化形成的類似小腸組織，其緊密連接比小腸中實際存在的緊接連接更為緊密，這可能會導致基于該模型評價親水性藥物腸滲透時與體內實際吸收有一定差距；②雖然Caco-2細胞能表達活性轉運蛋白系，但Caco-2 細胞中的轉運蛋白種類和數(shù)量與機體小腸細胞仍有一定的差別；③機體腸細胞的黏液層是小腸吸收的主要屏障之一，但Caco-2細胞缺乏存在于小腸上皮細胞中的黏液層，這使得Caco-2 細胞的屏障特性與小腸上皮細胞也存在一定的差異。因而，Caco-2 細胞模型會導致對親水性、通過細胞旁路和轉運蛋白介導轉運的化合物的腸滲透性預測能力變差。

外翻腸囊模型是研究藥物腸吸收常用的離體模型[21]，該模型的優(yōu)點[22]是實驗條件可控，減少了藥物吸收的影響因素，獲得的腸道吸收動力學參數(shù)更容易分析藥物在腸道的吸收特征；該模型的缺點在于[23]：腸囊內液體停滯不動，這與機體小腸的蠕動狀態(tài)的生理條件不同；另外，制備外翻腸囊時容易損傷腸粘膜，導致模型的腸壁細胞受損而影響模型的準確性。而在體灌流模型與體外實驗相比最大的優(yōu)點就是保持了小腸血管、淋巴和神經等主要生理系統(tǒng)的完好[9]，且模型中保留了各種轉運蛋白的完整性。該模型最接近機體內的狀態(tài)，更符合正常的生理條件，從而能夠更準確預測口服藥物在體內的吸收情況。但在體灌流模型也存在一定的不足：需要的動物數(shù)量較大，成本高，不同動物組別之間具有一定的差異性。所以在進行藥物腸滲透性研究時，考慮模型之間的差異很重要，有時需要幾種模型方法聯(lián)合應用，從而建立更好、更適宜的腸吸收預測模型，這樣才能提高對藥物的BCS分類判定的準確性。

P-gp 在小腸上皮細胞、肝膽管、腎小管及血腦屏障均有表達，它對經p-糖蛋白轉運的藥物的吸收、分布、排泄及藥物相互作用均有明顯影響[24]，所以基于P-gp的相互作用是目前研究的較多因素之一。P-糖蛋白在大鼠小腸的分布為從高到低腸段依次增加[25]，所以本實驗選擇P-gp相對含量較高的回腸作為滲透性研究的腸段。

P-gp具有ATP依賴性的藥物外排泵的功能，能將細胞內的藥物泵出細胞外使細胞內的藥物濃度降低[26]，因而腸道P-gp的功能活性和表達水平的變化可引起某些P-gp底物藥物的口服生物利用度改變，常通過聯(lián)合用藥來抑制P-gp的外排作用是提高藥物生物利用度的有效途徑，基于此，采用P-gp 抑制劑與抗癌藥物聯(lián)合應用已經成為抗腫瘤治療過程中對付多藥耐藥性的解決方案[27]。所以，建立基于P-糖蛋白的在體單向腸灌流模型，充分了解藥物之間在P-gp環(huán)節(jié)可能產生的相互作用，不論對于合理地聯(lián)合用藥，避免藥物毒性或不良反應，還是提高藥物滲透性分類的準確性都至關重要。

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[責任編輯 孔晶晶]