吳昊

摘 要：采用自然土壤法，研究了可生物降解PBSLA嵌段共聚物對(duì)蚯蚓超氧化歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）兩種抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，SOD和POD均在一定的時(shí)期內(nèi)受到了刺激作用，但這種刺激都比較小。低分子量共聚物的影響出現(xiàn)較早，高分子量共聚物的對(duì)蚯蚓的毒性影響經(jīng)過一定時(shí)間才表現(xiàn)出來，即滯后現(xiàn)象。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，?shí)驗(yàn)組中蚯蚓酶活的變化與空白組基本處于相同水平。總之，實(shí)驗(yàn)過程中蚯蚓未出現(xiàn)明顯的死亡現(xiàn)象，該聚合物對(duì)蚯蚓是安全的。

關(guān)鍵詞：聚丁二酸丁二醇酯-聚乳酸；蚯蚓；超氧化歧化酶過氧化物酶；過氧化物酶

研究發(fā)現(xiàn)由于聚酯中大量酯鍵的存在，所以很多聚酯能夠被微生物識(shí)別而發(fā)生微生物降解。其中聚丁二酸丁二醇酯（PBS）是一種具有廣泛應(yīng)用前景的可生物降解聚酯。所以研究該聚合物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的毒性是非常有價(jià)值的。

研究物質(zhì)對(duì)土壤環(huán)境毒性的一種常用的方法是利用蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)。經(jīng)過研究學(xué)者的努力，通過判斷蚯蚓體內(nèi)酶活的變化來判斷環(huán)境的污染程度已成為也一種標(biāo)準(zhǔn)。蚯蚓體內(nèi)的抗氧化物酶包括超氧化物岐化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）。其中SOD的作用是能夠?qū)C(jī)體內(nèi)的O2-轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，而CAT和POD可以將H2O2分解為氧氣和水。

關(guān)于其它可降解材料對(duì)蚯蚓的影響已有研究，然而關(guān)于PBSLA嵌段共聚物對(duì)蚯蚓體內(nèi)抗氧化物酶活的影響還沒有報(bào)道。因此，文章研究了PBSLA嵌段共聚物對(duì)蚯蚓體內(nèi)兩種抗氧化物酶活的影響。

1 試驗(yàn)材料與測(cè)試方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

所提供的試驗(yàn)樣品為實(shí)驗(yàn)室所合成PBSLA嵌段共聚物，分子量分別為5000、20000和30000。

1.1.2 試驗(yàn)試劑和測(cè)試儀器

考馬斯亮藍(lán)G-250；牛血清蛋白；DNS；葡萄糖。

組織粉碎機(jī)；人工培養(yǎng)箱。冷凍離心機(jī)。UV-2006A型可見紫外分光光度計(jì)。凝膠液相色譜儀。

1.1.3 供試蚯蚓和土壤

蚯蚓購于天龍蚯蚓養(yǎng)殖公司，實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理：選擇大小均勻（0.3-0.5g），生殖環(huán)比較明顯的健康成蚓。

自然突然實(shí)驗(yàn)法：取自咸陽郊區(qū)表土（0～20cm厚的地表土），烘干，研磨，過篩（10目，2mm），試驗(yàn)土壤為 土，全氮0.92g·kg-1，全磷0.82g·kg-1，土壤有機(jī)質(zhì)10.76g·kg-1（有機(jī)碳6.48g·kg-1），速效鉀289.0mg·kg-1，pH=8.4，堿解氮58.87mg·kg-1，速效磷14.5mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)步驟

根據(jù)OECD guideline No 207標(biāo)準(zhǔn)方法，進(jìn)行毒性試驗(yàn)研究。

1.2.1 蚯蚓預(yù)培養(yǎng)

將直徑為15cm的三層濾紙鋪在1l的燒杯中，滴加5ml去離子水，充分潤濕濾紙，并使得濾紙和燒杯底部無空隙存在。將試驗(yàn)所需蚯蚓放在濕潤的濾紙上。（注：蚯蚓數(shù)量不宜太多，可分為多個(gè)燒杯培養(yǎng)。）然后用濾紙將燒杯口封住，并用竹簽對(duì)濾紙進(jìn)行扎孔，最后將燒杯放入人工培養(yǎng)箱中，放置一晝夜。培養(yǎng)箱預(yù)設(shè)條件：20.5℃， 80%～85%的濕度。

毒性試驗(yàn)：分別將試驗(yàn)樣品（三種分子量的PBSLA共聚物）用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎10分鐘，稱取定量的粉末樣品（0.1%wt，0.5%wt，2.5%wt）與0.3g的試驗(yàn)土壤加到試驗(yàn)容器中進(jìn)行混合，攪拌均勻后，用噴霧器定量噴灑6ml自來水，控制容器內(nèi)的濕度在35%左右。取大小均勻的10條蚯蚓于試驗(yàn)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，用定性濾紙封口后，在用竹簽進(jìn)行均勻扎孔。最后試驗(yàn)容器在人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：20.5℃，80%～85%的濕度，每隔12個(gè)小時(shí)進(jìn)行光照培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣，然后進(jìn)行粉碎，提取，測(cè)試蚯蚓體內(nèi)酶活。試驗(yàn)周期為30天，且每組試驗(yàn)均設(shè)置3組平行樣進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.2 酶的提取

酶的提取方法：將取出來的每組蚯蚓用自來水進(jìn)行沖洗后，用濾紙擦干，放入組織粉碎機(jī)中，按照一定比例（1mg/ml）加入Tris-HCl緩沖溶液，對(duì)蚯蚓進(jìn)行粉碎，轉(zhuǎn)速為10000rpm的轉(zhuǎn)速，將得到的勻漿液用冷凍離心機(jī)進(jìn)行分離（冷凍離心條件：4℃，15000rpm，15分鐘）。取上清液0.5ml，加入0.05mol/l Tris-HCl緩沖液（pH為7.8）1ml，定容至1.5ml。

1.2.3 酶活的測(cè)定

酶活性測(cè)定：SOD活性的測(cè)定參考自俊青等（1998）的方法。POD活性的測(cè)定參考呂淑霞等（2003）的方法。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用軟件SPSS17.0將所得到的每組蚯蚓酶活數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PBSLA對(duì)SOD酶活的影響

從圖1可以看出，分子量為5.0×103的PBSLA處理組中，在第7d和第14d時(shí)（P<0.05），不同含量的處理組中均出現(xiàn)SOD增加的現(xiàn)象。這是由于剛開始由于蚯蚓周圍環(huán)境的變化，使得蚯蚓體內(nèi)的一些平衡被打亂，O2-增多，因此為了更好的適應(yīng)環(huán)境，蚯蚓通過自身的調(diào)節(jié)，使得體內(nèi)SOD酶分泌增加，活性也增加。到第28d和42d時(shí)（P<0.01），蚯蚓已能夠逐漸的適應(yīng)外界的環(huán)境，因此又恢復(fù)到與空白一樣的水平。圖2中可以觀察到，Mn為2.0×104的PBSLA實(shí)驗(yàn)中（P<0.05），第7d和第14d的變化規(guī)律與圖一中相似，只是變化趨勢(shì)有所減小。這是由于，分子量增加，聚合物中的小分子物質(zhì)有所減少，因此導(dǎo)致了能夠直接對(duì)蚯蚓產(chǎn)生影響的小分子物質(zhì)減少。從圖3中可以明顯的看出，聚合物分子量達(dá)到3.0×104時(shí)，不同的處理組中，SOD并沒有發(fā)生較明顯的變化。這是由于蚯蚓已經(jīng)適應(yīng)了周圍的環(huán)境，并且聚合物在降解過程產(chǎn)生的小分子不足以對(duì)蚯蚓的SOD產(chǎn)生較大的影響。

2.2 PBSLA對(duì)POD酶活的影響

從圖4中可以看出，實(shí)驗(yàn)組中POD的活性均表現(xiàn)出一定的規(guī)律性：POD酶活隨聚合物含量的增加而增加，當(dāng)聚合物的含量為0.5%wt時(shí)，酶活變化的速率最大，經(jīng)過一段時(shí)間后酶活又開始緩慢增加（P<0.05）。這是由于剛開始蚯蚓周圍環(huán)境的變化，使得蚯蚓機(jī)體內(nèi)POD所分解的物質(zhì)增加，因此，為了更好的適應(yīng)環(huán)境，POD活性也開始增加。從圖5中可以觀察到第7d和第14d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中的POD活性沒有發(fā)生明顯的變化，而從第32d開始（P<0.01），POD活性逐漸的增加，與圖1中相比，出現(xiàn)了明顯的滯后現(xiàn)象。這說明了聚合物在降解時(shí)是一個(gè)比較緩慢的過程，由于剛開始聚合物中的小分子比較少，且沒有發(fā)生降解，因此不足以對(duì)蚯蚓產(chǎn)生影響，而隨著時(shí)間的增長，聚合物逐漸的發(fā)生降解，因此這種作用到后期才表現(xiàn)出來。圖6更加說明了聚合物含量為2.5%時(shí)，從第32d開始，POD才出現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)（P<0.05）。

3 結(jié)束語

（1）蚯蚓體內(nèi)不同種酶對(duì)聚合物所做出的反應(yīng)不同，敏感程度表現(xiàn)為SOD>POD。（2）低分子量聚合物對(duì)蚯蚓的影響較高分子量的要大些，但是都是短暫的，最終的結(jié)果均表現(xiàn)為與空白組相同的水平。（3）在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，蚯蚓并沒有出現(xiàn)明顯的死亡、環(huán)節(jié)脫落、尾溶等現(xiàn)象，所以初步判定PBSLA共聚物對(duì)蚯蚓是安全的。