劉洪杰，徐晶，趙由才，宋立巖

（1.中國科學院重慶綠色智能技術(shù)研究院環(huán)境微生物與生態(tài)研究中心，重慶400714；2.中國科學院大學，北京100049；3.同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海200094）

生活垃圾填埋場微生物群落結(jié)構(gòu)與功能*

劉洪杰1，2，徐晶1，2，趙由才3，宋立巖1

（1.中國科學院重慶綠色智能技術(shù)研究院環(huán)境微生物與生態(tài)研究中心，重慶400714；2.中國科學院大學，北京100049；3.同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海200094）

生活垃圾進入到衛(wèi)生填埋場后，在微生物菌群的作用下經(jīng)歷了好氧、厭氧酸化、初期產(chǎn)甲烷以及穩(wěn)定產(chǎn)甲烷階段逐步達到穩(wěn)定，同時其有機質(zhì)最終生物轉(zhuǎn)化為甲烷。對基于傳統(tǒng)微生物技術(shù)與新發(fā)展的宏基因組等生物技術(shù)研究填埋場各階段微生物菌群結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)果進行綜述，發(fā)現(xiàn)生活垃圾組成異質(zhì)化及垃圾所處環(huán)境不同造成了填埋場微生物群落因地各異。并提出了此環(huán)境群落變化的主要研究難點和研究方向。

填埋場；微生物群落結(jié)構(gòu)與功能；甲烷氧化菌

垃圾被填埋后，垃圾中的可降解組分經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物化學反應(yīng)最終得以分解。各種不同微生物通過對物質(zhì)的競爭及相互間的協(xié)同作用共同完成對垃圾的降解過程［1］。垃圾降解一般經(jīng)歷4個階段：好氧階段、厭氧酸化階段、初始產(chǎn)甲烷階段和穩(wěn)定產(chǎn)甲烷階段［2］。由于各階段環(huán)境條件與基質(zhì)具有差異，因此各階段微生物種群各不相同［1］。盡管垃圾的組分有很大的差異，但是生活垃圾中均含有較多的有機質(zhì)，例如纖維素和半纖維素等［3］。這些有機質(zhì)在經(jīng)歷上述的降解過程后最終轉(zhuǎn)化為甲烷。而實現(xiàn)纖維素等有機質(zhì)降解至甲烷這一過程的主要菌群包括：纖維素水解菌群、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群等［1，4-5］。填埋場運行過程產(chǎn)生大量的甲烷及其他氣體混合物（二氧化碳、硫化氫、鹵代烴和芳香族等）在逸散過程中會馴化填埋場覆土，引起覆土微生物群落結(jié)構(gòu)與填埋體明顯不同，其中重要的差異即覆土微生物菌群含有大量的甲烷氧化菌［6］。

相比污水處理廠、污染土壤等環(huán)境介質(zhì)，垃圾填埋場作為一個特殊的環(huán)境單元，其微生物演替過程研究較少。Peter Kjeldsen等綜述了填埋場垃圾降解過程滲瀝液理化指標變化［2］；楊琦等綜述了影響填埋場內(nèi)垃圾降解的因素，分析了其中的微生物種類和數(shù)量及其相互關(guān)系［7］；Balaz等通過傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基對垃圾降解過程中的微生物變化進行了較為詳細研究［1］；Jeremy等在菌株和16S rRNA克隆文庫水平研究基礎(chǔ)上對填埋場垃圾降解過程微生物群落的演化規(guī)律進行綜述［8］。近10 a生物技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是宏基因組等技術(shù)廣泛運用到環(huán)境介質(zhì)微生物群落的研究中，讓我們意識到自然界微生物數(shù)量及種類的巨大多樣性，而可培養(yǎng)的微生物大約只有1%。因此本研究對過去20 a基于傳統(tǒng)微生物技術(shù)與新發(fā)展的宏基因組等分子生物學技術(shù)研究填埋場微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)果進行綜述，為填埋場的運行管理以及設(shè)計新一代衛(wèi)生填埋場提供微生物學的理論支持。

1 填埋場微生物群落的主要演替規(guī)律

填埋場內(nèi)各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)化并非特異的存在于某一個特定的時期，而是貫穿于整個穩(wěn)定化過程之中，但是每個特定階段占主導(dǎo)的微生物種類不同或者某一微生物的作用凸顯，引起宏觀上的特征參數(shù)發(fā)生變化，因此可以人為的將填埋場穩(wěn)定化過程劃分為4個階段：好氧階段、厭氧酸化階段、初始產(chǎn)甲烷階段和穩(wěn)定產(chǎn)甲烷階段［1-2］。

1.1 好氧階段（Aerobic phase）

填埋場覆土封場后，垃圾降解進入到初始好氧階段。填埋初期，殘留在新鮮垃圾縫隙空間的氧氣迅速地被消耗，使簡單有機物發(fā)生好氧生物降解生成二氧化碳和水并產(chǎn)生大量的熱［2］。垃圾的好氧生物降解過程是垃圾中可溶性有機物透過微生物細胞壁與細胞膜被微生物直接吸收，不溶性有機物被吸附在微生物體外，在微生物分泌的胞外酶的作用下水解成小分子可溶性物質(zhì)，再滲入細胞，然后在微生物的合成代謝與分解代謝作用下被消耗掉的過程［9］。此階段填埋場內(nèi)部溫度迅速升高但僅維持數(shù)天，產(chǎn)生的填埋氣主要為微生物好氧分解代謝所產(chǎn)生的二氧化碳［1］。由于此階段反應(yīng)非常迅速，無論是可培養(yǎng)或者不可培養(yǎng)技術(shù)均對此階段的微生物群落結(jié)構(gòu)鮮有研究。

1.2 厭氧酸化階段（Anaerobic acid phase）

伴隨氧氣快速耗盡，填埋場迅速成為一個厭氧環(huán)境。在厭氧條件下，高分子有機物如纖維素和半纖維素被胞外酶緩慢水解成小分子可溶性有機物，與上階段未消耗的糖類一同厭氧發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸、乙醇和二氧化碳，最后被產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌利用生成乙酸和氫氣，導(dǎo)致羧酸積累。在此階段，水解、發(fā)酵和產(chǎn)乙酸細菌占主要優(yōu)勢［2］。在水解和酸化電子傳遞的過程中微生物都會消耗一定的NH4+和堿度，較強的水解酸化作用使得該階段pH下降［10］。這一階段的菌群主要包括：纖維素水解菌群、產(chǎn)酸菌群和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群。

由454測序技術(shù)分析處于該時期的一個滲瀝液樣品可知：厚壁菌門（Firmicutes）是最主要的細菌門類，與變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和螺旋體門（Spirochaetes）一共占總細菌序列的90%左右［11］。填埋場中厚壁菌門與擬桿菌門細菌主要功能是水解纖維素和淀粉等多糖，變形菌門可以分解可溶性糖類為單糖和短鏈脂肪酸［12］。

1.2.1 纖維素水解菌群

自然界中可以降解纖維素的物種絕大多數(shù)分布在細菌域和真核生物域的真菌界中。好氧纖維素水解細菌多為放線菌門（Actinobacteria）的放線菌目（Actinomycetales），而厭氧多為厚壁菌門中的梭菌目（Clostridiales）［13］。纖維素水解細菌主要包含：厭氧發(fā)酵細菌、好氧革蘭氏陽性細菌和好氧滑動細菌。厭氧發(fā)酵型纖維素水解細菌通常是梭菌屬（Clostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和熱解纖維素果汁桿菌屬（Caldicellulosiruptor）的革蘭氏陽性菌，但也包含一些丁酸弧菌屬（Butyriv ibrio）、醋酸弧菌屬（Acetivibrio）和纖維桿菌屬（Fibrobacter）等革蘭氏陰性菌；好氧革蘭氏陽性纖維素水解細菌有纖維單胞菌屬（Cellulomonas）和高溫雙歧菌屬（Thermobifida）［14］；好氧纖維素水解滑動細菌有噬纖維菌屬（Cytophaga）和生孢噬纖維菌屬（Sporocytophaga）［13］。

垃圾中纖維素物質(zhì)占40%～70%［15］，代表填埋場最豐富的可生物降解有機質(zhì)，因此研究填埋場水解菌群的主要對象為纖維素水解種群。在填埋場群落的研究過程中，已發(fā)現(xiàn)的可水解纖維素的微生物除了早期Hungate通過分離培養(yǎng)獲得的丁酸弧菌和瘤胃球菌屬外還有：梭菌屬［16-18］、醋酸弧菌屬［16］、纖維桿菌屬［19-20］、微桿菌屬（Microbacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）［20］、優(yōu)桿菌屬（Eubacterium）［18］、溶桿菌屬（Lysobacter）［21］、纖維單胞菌屬、鏈霉菌屬（Streptomyces）等細菌以及真菌中的毛霉屬（Mucor）［22］和新美鞭菌目（Neocallimastigales）［23］。研究發(fā)現(xiàn)纖維素的厭氧降解過程則可能主要由梭菌屬（厚壁菌門）和/或纖維桿菌屬（纖維桿菌門）控制［12，15，19］。

可能受填埋場初期大量羧酸和好氧階段后仍剩余的小分子糖類等的抑制作用，模擬實驗中厭氧纖維素水解菌群后期才表現(xiàn)出較快的生長跡象［1］。實地填埋場好氧纖維素水解菌的研究發(fā)現(xiàn)在不同填埋區(qū)域，好氧纖維素水解細菌個數(shù)差別較大難以進行比較［20］。纖維素水解過程較慢，可能在穩(wěn)定產(chǎn)甲烷期間決定著產(chǎn)甲烷的速率［1］。

1.2.2 產(chǎn)酸細菌

厭氧發(fā)酵過程可以將糖類轉(zhuǎn)變?yōu)槎替溨舅幔ㄒ宜帷⒈?、丁酸）、乙醇、二氧化碳和氫氣。在填埋場中大多?shù)發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)微生物都需要厭氧呼吸進行生長從而完成這一過程。填埋場中可能與產(chǎn)酸相關(guān)的細菌有厚壁菌門中的梭菌屬、Sedimentibacter、Anaerobranca、Atopostipes及優(yōu)桿菌屬、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和擬桿菌門中的Proteiniphilum、普氏菌屬（Prevotella）及Petrimonas還有梭桿菌門（Fusobacteria）［11-12，21］。

1.2.3 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌

產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌是一類嚴格厭氧的真細菌，可以轉(zhuǎn)化發(fā)酵產(chǎn)物中的短鏈脂肪酸（除乙酸）和醇類為乙酸、氫氣和二氧化碳等，但這一過程大多需要和產(chǎn)甲烷細菌等共同完成［24］。填埋場中有機酸尤其是乙酸的產(chǎn)生過程仍是一個黑箱模型［8］，而且由于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌大多為專性互營細菌，很難在填埋場微生物群落的探索過程中對其進行獨立的培養(yǎng)和研究。在填埋場的研究中檢測到的能夠產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌的屬有Atopostipes、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、Proteiniphilum、Petrimonas、Pelotomaculum、Gelria［11-12］。

1.3 初始產(chǎn)甲烷階段（Initial methanogenic phase）

不同填埋場的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌如表1所示。垃圾降解進入初始產(chǎn)甲烷階段時可明顯檢測到甲烷的產(chǎn)生。微生物利用乙酸為電子供體會產(chǎn)生一定的堿度，從而引起環(huán)境pH升高［10］。解除了過酸環(huán)境抑制作用的產(chǎn)甲烷古細菌隨后開始利用酸化階段積累的羧酸并生成甲烷和二氧化碳，其中氫氣/二氧化碳和乙酸是主要基質(zhì)。纖維素和半纖維素的水解也隨著環(huán)境pH上升而逐步消除抑制開始進行［2］。由于產(chǎn)甲烷過程最后一步轉(zhuǎn)化主要由產(chǎn)甲烷菌完成，因此該階段微生物菌群研究主要集中在產(chǎn)甲烷古細菌，而對于真細菌研究較少。

表1 不同填埋場的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌

宋立巖等用454高通量測序技術(shù)對處于此階段的填埋場滲瀝液樣品進行了研究，結(jié)果表明在初始產(chǎn)甲烷階段的一個時間點上細菌群落構(gòu)成為：變形菌門占總細菌的59.6%，厚壁菌門占21.3%，擬桿菌門占11.5%，而其他門類包括酸桿菌門、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）等組成了剩下的7.6%。在屬分類上則是假單胞菌屬（Pseudomonas）占53.5%，未分類Ruminococcaceae占8.3%，Petrimonas占6.2%，Sulfurimonas占4.6%［25］。

產(chǎn)甲烷菌隸屬于古菌域中的廣古菌門（Euryarchaeota），是嚴格厭氧的原核生物，根據(jù)營養(yǎng)類型分為氫營養(yǎng)型、乙酸營養(yǎng)型和甲基營養(yǎng)型3類。以系統(tǒng)發(fā)育為主的產(chǎn)甲烷菌最新分類將產(chǎn)甲烷菌分為5個大目：甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷火菌目（Methanopyrales）和甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）［26］。目前能夠利用乙酸產(chǎn)甲烷的只有甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）和甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）2個屬［27］。填埋場垃圾降解過程中產(chǎn)甲烷菌有一定的多樣性，優(yōu)勢菌主要為甲烷桿菌目、甲烷微菌目和甲烷八疊球菌目［28-30］。甲烷桿菌目和甲烷微菌目所包含的菌屬主要是氫營養(yǎng)型，甲烷八疊球菌目的菌屬有氫營養(yǎng)型、乙酸營養(yǎng)型以及甲基營養(yǎng)型。氫營養(yǎng)型的甲烷微菌目和甲烷八疊球菌目已經(jīng)在模擬填埋場反應(yīng)器中以優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌被發(fā)現(xiàn)［16，31］。而以滲瀝液為研究對象的實驗則有些發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢類群為乙酸型的甲烷八疊球菌屬和甲烷鬃菌屬以及氫營養(yǎng)型的甲烷桿菌目［28，32］，還有些研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢類群為甲烷微菌目［29］。

填埋場長時間的定向選擇可能會使得老齡垃圾中產(chǎn)甲烷菌多樣性低于低齡垃圾［33］。根據(jù)反應(yīng)器模擬，垃圾的產(chǎn)甲烷過程可分為3個階段：第1階段由氫營養(yǎng)型主導(dǎo)，第2階段乙酸營養(yǎng)型顯著升高，成為主要營養(yǎng)類型，第3階段乙酸營養(yǎng)型逐漸降低，最終氫營養(yǎng)型再次占優(yōu)勢［34］。但這種規(guī)律在實地填埋場中并未得到驗證。各填埋場所具有的產(chǎn)甲烷菌生長規(guī)律可能隨著各地垃圾組分和操作環(huán)境不同而有所變化（見表1）。

1.4 穩(wěn)定產(chǎn)甲烷階段（Stable methanogenic phase）

垃圾中的羧酸逐步被耗盡后，盡管發(fā)酵細菌產(chǎn)酸速率較快，但纖維素和半纖維素水解過程進行得比較緩慢，因此產(chǎn)甲烷速率不再加快，垃圾進入穩(wěn)定產(chǎn)甲烷階段。在此階段由纖維素和半纖維素水解速率決定了產(chǎn)甲烷速率。羧酸產(chǎn)生與消耗達到一個動態(tài)平衡，pH上升至一個穩(wěn)態(tài)范圍［2］。

由454高通量測序分析表明在穩(wěn)定產(chǎn)甲烷階段一個時間點上細菌群落主要構(gòu)成為：擬桿菌門占總細菌的49.4%，變形菌門占39.9%，厚壁菌門占4.3%，而其他門類包括硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門、綠菌門（Chlorobi）和綠彎菌門（Chloroflexi）等組成了剩下的7.6%。精確到屬后優(yōu)勢菌分別是Fluviicola、Balneola、極小單胞菌屬（Pusillimonas）各占13.4%、13.1%和7.1%，而假單胞菌屬則只占2.7%。古細菌群落組成為：甲烷微菌目占57.6%，鹽桿菌目（Halobacterials）占20.3%，熱原體目（Thermoplasmatales）占2.8%，甲烷八疊球菌目占3.3%，甲烷桿菌目占1.2%［25］。

填埋過程有機物最終轉(zhuǎn)化為的甲烷是一種溫室氣體，會加劇全球變暖的過程。甲烷在逸散的過程會與垃圾和覆土接觸，能馴化出可以氧化甲烷的物種。上覆土為甲烷氧化的主要場所［6］。甲烷氧化菌以甲烷為唯一碳源和能源，可以分泌甲烷單氧酶氧化甲烷為甲醇。而后甲醇在甲醇脫氫酶的作用下氧化為甲醛，繼而在甲醛脫氫酶的催化下氧化為甲酸，最后經(jīng)甲酸脫氫酶氧化成二氧化碳。大部分甲烷氧化菌在分類學中屬于γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）［37］。從填埋場覆土中發(fā)現(xiàn)的可以氧化甲烷的物種有甲基暖菌屬（Methylocaldum）、嗜甲基營養(yǎng)菌屬（Methyloversatilis）［38］、甲基桿菌屬（Methylobacter）、甲基囊孢菌屬（Methylocystis）［39］、甲基熱菌屬（Methylothermus）、甲基微菌屬（Methylomicrobium）、甲基彎曲菌屬（Methylosinus）［40］和甲基八疊球菌屬（Methylosarcina）［41］。而邢志林等對覆土甲烷氧化進行模擬研究發(fā)現(xiàn)：隨覆蓋層梯度增加甲基桿菌屬細菌比例呈現(xiàn)減小趨勢而甲基球菌目呈現(xiàn)增加趨勢［39］。填埋場覆土中甲烷氧化過程的優(yōu)勢菌種多為I型甲烷氧化菌中的甲基桿菌屬和II型甲烷氧化菌的甲基囊孢菌屬［39-41］。由于I型甲烷氧化菌對比于II型甲烷氧化菌有更高的甲烷親和性，那么可以猜測在填埋場覆土靠近地表部分甲烷濃度低而有利于I型甲烷氧化菌，而靠近垃圾層及其垃圾層內(nèi)部由于高濃度甲烷而更有利于II型甲烷氧化菌生長，不過并未有實驗來驗證這一結(jié)論。

2 討論與展望

生活垃圾組成異質(zhì)化及垃圾所處環(huán)境不同造成了填埋場微生物群落因地各異［20，29］。因此對這一生境微生物群落結(jié)構(gòu)與功能研究非常困難。目前對此環(huán)境群落變化研究的主要難點在于：采樣代表性問題和群落結(jié)構(gòu)長期監(jiān)測的可行性問題。

填埋場內(nèi)部物質(zhì)分布不均勻可能造成了同一填埋場內(nèi)不同區(qū)域的微生物群落結(jié)構(gòu)不同［29］，甚至不同區(qū)域可能處在不同的垃圾降解時期。以滲瀝液中的微生物作為填埋垃圾微生物的代表有一定的合理性，但是一些黏附于垃圾表面形成生物膜的種類可能不易于隨滲瀝液排出，且微生物下滲后在收集單元內(nèi)與營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，勢必也會發(fā)生一些變化，因而不能單獨用來精確地描述填埋場內(nèi)部復(fù)雜的生理狀況［42］。

以往對填埋場內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)的研究往往只在一個時間點上進行，沒有連續(xù)的監(jiān)測微生物群落結(jié)構(gòu)變化也導(dǎo)致對該生境微生物結(jié)構(gòu)與功能的了解不足。填埋場一經(jīng)覆土很難對其內(nèi)部進行長期檢測，如果在搭建初期就將這一問題作為考慮范圍，對該生境研究、管理和考核都有重要的意義。

盡管宏基因組等分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速，但是其應(yīng)用到垃圾降解過程甚少。有限的應(yīng)用宏基因組技術(shù)的研究一定程度上揭示了垃圾降解過程巨大的微生物群落結(jié)構(gòu)與功能。但垃圾填埋場的管理（甲烷產(chǎn)生、回收等）以及下一代快速穩(wěn)定垃圾填埋場的設(shè)計仍需要更全面的微生物學支持。有關(guān)填埋場內(nèi)部微生物種群和群落的生態(tài)以及不同微生物類群之間的相互作用仍有待更深入的研究。

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Microbial Community Structure and Function in Municipal Solid Waste Landfill

Liu Hongjie1，2，Xu Jing1，2，Zhao Youcai3，Song Liyan1
（1.Environmental Microbiology and Ecology Research Center，Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology，Chinese Academy of Sciences，Chongqing400714；2.University of Chinese Academy of Scienses，Beijing100049；3. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，Tongji University，Shanghai200094）

After buried，municipal solid waste（MSW）undergoes a series of reaction phases（aerobic phase，anaerobic acid phase，initial methanogenic phase，and stable methanogenic phase）and consequently reaches to stable phase.At the same time，the organic matter is converted into methane by microbial community.Traditional microbiology technique and the emerging metagenomics techniques have been used to investigate the variation of microbial community structure and function during refuse decomposition in landfill.We reviewed the related studiesand found that the heterogeneity of refuse and local environment are the main factorsin shaping microbial community structure and function.Based on these findings，the obstacle and further study were discussed.

landfill；microbial community structure and function；methanotroph

X705；Q938

A

1005-8206（2017）02-0005-06

劉洪杰（1991—），碩士研究生，主要研究方向為固體廢物處置與資源化。

E-mail：liuhongjie@cigit.ac.cn。

宋立巖，副研究員。

E-mail：songliyan@cigit.ac.cn。

國家自然科學基金(51578528)

2016-11-06