張巍，王清君，郭興

(伊春林業(yè)科學院，黑龍江 伊春 153000)

紅松不同種源的遺傳多樣性分析

張巍，王清君，郭興

(伊春林業(yè)科學院，黑龍江 伊春 153000)

紅松是小興安嶺林區(qū)的主要建群樹種，在小興安嶺總體生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)地位。為了保證小興安嶺林區(qū)紅松的遺傳豐富度，為小興安嶺林區(qū)提供優(yōu)質(zhì)的紅松造林苗木。研究運用10個經(jīng)過篩選后的引物，用ISSR分析方法對10個不同紅松天然林種源進行了分子標記分析。結(jié)果顯示：①10個ISSR引物共檢測到的位點數(shù)在2～13之間，各位點的 DNA 片段長度介于 150～2 000 bp 之間。②共檢測到79個位點，平均每個 ISSR 引物檢測到9.9個位點。③多態(tài)性條帶為65條，多態(tài)性位點百分率為42.63%。④各種源在分子層面存在明顯差異，而這一差異與地理分布呈正相關(guān)。⑤小興安嶺林區(qū)紅松群落的遺傳豐富度較高，這也有效的保證了小興安嶺紅松群落的林分質(zhì)量。

紅松；遺傳豐富度；ISSR

0 引言

紅松(Pinuskoraiensis)是我國珍貴的用材樹種[1-2]，而天然闊葉紅松林是經(jīng)過長期自然選擇形成的原始群落[3]，同時也是小興安嶺林區(qū)的地帶性頂級群落[4]。小興安嶺伊春林區(qū)是我國紅松的主分布區(qū)之一，曾經(jīng)分布著大面積的紅松原始林，但20世紀60、70年代經(jīng)受了嚴重破壞。雖然現(xiàn)在每年都有大面積的造林計劃進行，但伊春林區(qū)的紅松原始林目前仍然處于恢復階段。而隨著造林任務的深入，不同種源的遺傳豐富度表現(xiàn)出一定差異，造林質(zhì)量也存在差異。近年來，如何有效的保存現(xiàn)有紅松原始林的遺傳多樣性，提高闊葉紅松林的遺傳豐富度，一直是林業(yè)工作者共同努力的方向。為了揭示紅松不同種源間遺傳多樣性的差異，本研究收集了包括小興安嶺、長白山等紅松主分布區(qū)在內(nèi)的天然紅松母樹林優(yōu)樹子代，用ISSR-PCR分子標記分析方法對各種源及種源內(nèi)家系進行了分子標記分析，希望可以為紅松不同種源的綜合評價及利用提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選擇

試驗共選定10個地區(qū)的紅松原始林為種源選擇區(qū)，各種源區(qū)具體情況見表1。

依據(jù)種源區(qū)域，選擇鐵力林業(yè)局種源家系8株，五營林業(yè)局種源家系10株，湯旺河林業(yè)局種源家系12株，帶嶺林業(yè)局種源家系9株，新青林業(yè)局種源家系10株，吉林省長白山1號種源家系10株(吉林，安圖)，吉林省長白山2號種源家系10株(吉林，蛟河)，雙鴨山市種源家系10株，友好林業(yè)局種源家系10株，牡丹江市種源家系10株，共99株單株樣本。

表1 種源區(qū)立地條件統(tǒng)計

1.2 反應體系建立

1.2.1 紅松總DNA提取

試驗參考馮富娟等的試驗方法[4-9]。采用CTAB提取紅松針葉總DNA，從上清液中獲取的DNA得率高，DNA電泳條帶清晰。

1.2.2 ISSR-PCR

反應體系為20 μL，包括1×Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，引物1.5 ng/(μL),dNTP的濃度為0.2 mmol/L，TaqDNA聚合酶的用量為0.5U，模板DNA的用量為20～40 ng，TaqDNA聚合酶、引物、dNTP由上海生工生物工程公司提供。見表2。

PCR反應程序為：94℃ 預擴增7 min；94℃變性 30s，52℃退火 45s，72℃延伸 2 min，40個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。

1.2.3 電泳檢測及數(shù)據(jù)處理

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠，在不超過5 V/cm的電壓下電泳，電極緩沖液為1×TAE，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.4 DNA指紋圖譜建立

將瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)DNA片段的記為1，不出現(xiàn)的為0，統(tǒng)計后輸入電腦，用NTSYS聚類分析軟件進行UPGMA法聚類分析，用POPGENE32軟件進行數(shù)據(jù)處理。

表2 ISSR引物編號及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 種源間ISSR的多態(tài)性

對10個種源進行PCR擴增。擴增片段分子量主要集中在200～1 500 bp之間。共擴增片段條帶501條，其中多態(tài)性條帶289條。各引物擴增出的條帶數(shù)目從20至84不等。引物p13擴增出的條帶數(shù)最多，為49條。引物P807擴增出891個遺傳位點，為10個引物中最多(圖1～圖4)。以上數(shù)據(jù)表明紅松種間在分子水平上的多態(tài)性是豐富的，利用ISSR分子標記能夠檢測紅松多種源間的親緣關(guān)系[10-13](表3)。

圖1 天然紅松ISSR電泳圖譜，引物p5Fig.1 Pine ISSR gel electrophoresis primer P5

圖2 天然紅松ISSR電泳圖譜，引物p11Fig.2 Pine ISSR gel electrophoresis primer P11

圖3 天然紅松ISSR電泳圖譜，引物p13Fig.3 Pine ISSR gel electrophoresis primer P13

圖4 天然紅松ISSR電泳圖譜，引物p807Fig.4 Pine ISSR gel electrophoresis primer P807

引物名稱P3P5P8P10P11P13P815P807P817P818擴增條帶數(shù)59428449436120594638多態(tài)條帶4138463117490312412多態(tài)條帶比率/%41475418238752833445503444342924

2.2 遺傳多態(tài)位點分析

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，也是生物多樣性最重要的部分[13-15]。通過對10個種源的遺傳多樣性進行統(tǒng)計分析表明，湯旺河種源區(qū)遺傳性最為豐富，其總條帶數(shù)為34條，多態(tài)性條帶數(shù)42條，多態(tài)性條帶百分比53.16%，該種區(qū)為各種源最高，其次為帶嶺種源區(qū)，總條帶數(shù)為44條，多態(tài)性條帶35條，多態(tài)性條帶百分比為44.30%。五營種源區(qū)總條帶數(shù)46，其中多態(tài)性條帶數(shù)33，多態(tài)性條帶比率為41.77%，相對較高(表4)。

從表4可知，不同種群的多態(tài)位點比率在25.32%～53.16%。其中，在10個種源區(qū)劃中，湯旺河種源區(qū)和帶嶺種源區(qū)的遺傳多樣性最為豐富。五營種源區(qū)遺傳多態(tài)位點比率也達到了41.77%，在本次所收集的種源中多態(tài)位點比率較高。長白山2號種源區(qū)、新青種源區(qū)和雙鴨山種源區(qū)的多態(tài)位點比率最少，分別為25.32%、27.85%、29.11%，證明其遺傳豐富度較差。

比較中，小興安嶺種群區(qū)域和長白山種群區(qū)域的多態(tài)位點比率都高于做為兩個紅松主分布區(qū)中間帶的雙鴨山和牡丹江種群區(qū)，證明做為我國國內(nèi)的紅松主分布區(qū)，兩種群都在長期的進化中保證了種群自身的遺傳豐富度。丁慶祝等[16]以5年生紅松種源為實驗材料，證明了紅松不同地理種源間遺傳差異是極顯著的。

表4 各生態(tài)區(qū)和種群多態(tài)位點統(tǒng)計

2.3 遺傳變異分析

Nei指數(shù)(H)、Shannon指數(shù)(I)和有效等位基因數(shù)(Ne)是衡量種源遺傳多樣性的重要參數(shù)。為了分析紅松各種群內(nèi)和種群間的遺傳變異，對紅松10個種源進行了遺傳多樣性分析(表5)。

表5 紅松各種源遺傳多樣性

從表5來看，除Shannon指數(shù)I比Nei指數(shù)H稍高一點外，各種源遺傳多樣性指數(shù)基本一致。其中，帶嶺種源的Shannon指數(shù)I最低，為0.838 5，其次為友好種源。Shannon指數(shù)I最高的種源為長白山2號種源和新青種源。結(jié)果表明，紅松種源Nei遺傳多樣性指數(shù)總體區(qū)間在0.403 3～0.874 4。Shannon遺傳多樣性指數(shù)總體區(qū)間在0.514 2～1.025 3。各種源總的Nei遺傳多樣性指數(shù)為0.631，總Shannon多樣性指數(shù)I為0.839 1。

2.4 各種源間的遺傳距離和親緣關(guān)系

對紅松10個種源的99株單株個體進行聚類分析表明，10個種源基本可以分為兩大類群，即包括鐵力、帶嶺、友好、新青、五營、湯旺河等在內(nèi)的小興安嶺紅松群落和包括長白山1號種源、長白山2號種源、牡丹江、雙鴨山等在內(nèi)的長白山紅松群落。鐵力，友好，新青，五營，帶嶺、湯旺河等6個種源組內(nèi)的單株個體在遺傳距離上并沒有明顯的集群分類。

3 結(jié)論

(1)對10個種源99株單株優(yōu)樹進行遺傳多樣性及遺傳分化的分析，共檢測出有效位點7 821個，其中多態(tài)性位點數(shù)3 334個。分析結(jié)果證明，10個種源基本可以劃分為小興安嶺林區(qū)、長白山林區(qū)和林區(qū)過渡帶三個大的種源區(qū)劃。而以雙鴨山種源區(qū)、牡丹江種源區(qū)為代表的過渡帶，遺傳距離更接近于長白山林區(qū)。

(2)試驗分析證明，小興安嶺紅松區(qū)組總擴增位點數(shù)為4 661個，多態(tài)位點數(shù)2 135個?？偟亩鄳B(tài)位點比率為45.81%。長白山紅松區(qū)組總擴增位點數(shù)為1 580個，總多態(tài)位點率39.30%。雙鴨山和牡丹江種源區(qū)組總擴增位點數(shù)為1 580個，總多態(tài)位點數(shù)為576個，總多態(tài)位點比率為36.48%。由此看出，無論是各種源組間比較或組內(nèi)比較，小興安嶺林區(qū)總的多態(tài)位點比率都相對較高，證明具有更高的遺傳豐富度，組內(nèi)存在更好的基因流動性，可以更為有效的保證種源間基因雜合的豐富度，從而近一步保證林分質(zhì)量。

(3)對所收集的10個紅松種源進行分子標記分析證明，紅松各種源的遺傳差異在分子層面是顯著的。而這種差異的顯著性在一定程度上與地理分布關(guān)系密切。由此也證明，與其它植物相比，紅松種源間的遺傳距離受空間限制機率更小，其自身具有較高水平的基因流動。這也是紅松在長時間的進化過程中為有效防止基因空間異質(zhì)性而產(chǎn)生的生理對策。

4 討論

紅松自然分布地域狹長，從小興安嶺到長白山，幾千公里，地理及氣候條件差異很大，不同亞區(qū)的優(yōu)樹子代具有不同的生態(tài)適應性[16]。馮富娟等對露水河紅松種子園內(nèi)7個無性系種源進行聚類分析，表明黑龍江的4個種源遺傳關(guān)系較近，而長白山的3個種源遺傳關(guān)系同樣較近[9]，這與本文研究基本相同。但本次研究得到的多態(tài)位點比率較高，最終確定的種源區(qū)劃也稍有差異，這可能是由于試驗條件及選擇樣本方法不同產(chǎn)生的。本次種源選擇完全是在紅松天然母樹林完成，樣本樹齡從128～444 a不等，共分4個層級進行采集，樹齡跨度較大。這一齡級跨度的紅松原始林基本未受人為干擾，物種豐富度可以被更好的保留。其次，本次研究選擇種源區(qū)較多，且每個種源區(qū)在采集的過程中都對不同樹齡層級的樣本進行了采集，樣本數(shù)的增加增大了位點被檢測到的幾率。

小興安嶺和長白山紅松林地理距離較遠，而紅松林的群落組成及垂直植被層各有特點，差異較大[17]。張恒慶等在對天然紅松林時間尺度遺傳多樣性變化和遺傳分化進行分析后，證明紅松在時間尺度具有一定波動[17]。丁慶祝等[18]以5 a生紅松種源為實驗材料，證明紅松不同地理種源間遺傳差異是顯著的。而做為主分布區(qū)之一的小興安嶺紅松林群落，由于包括土壤、氣候等自然因子和種群內(nèi)基因流動及雜合程度的復雜性，而形成了自身的群落穩(wěn)定性。

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Study on the Genetic Diversity ofPinusKoraiensisin Different Provenances

Zhang Wei，Wang Qingjun，Guo Xing

(Yichun Academy of Forestry sciences，Yichun，153000)

Pinus koraiensis is the main tree species in Xiaoxing'anling forest，and of important ecological status in the overall ecological system of Xiaoxing'anling area.In order to ensure the genetic richness of Pinus koraiensis in Xiaoxing'anling forest region，and provide high quality Pinus koraiensis afforestation seedlings for Xiaoxing’anling forest area，10 primers were screened and 10 different Korean pine natural provenances were analyzed by ISSR in this study.The results showed that the points were detected by 10 ISSR primers were between 2～13loci，DNA fragment length of each point was between 150～2000 bp.79 loci were detected，and 9.9 loci was detected by ISSR primers on the average.Polymorphic bands for the 65 polymorphic loci was 42.63%.There was a significant difference in the molecular level of the various sources，and this difference was positively correlated to the geographical distribution.The genetic richness of Pinus koraiensis community was higher in Xiaoxing'anling forest area，which effectively ensured the quality of Pinus koraiensis community in Xiaoxing'anling.

korean pine；genetic richness；ISSR

2016-10-24

黑龍江省森林工業(yè)總局科技攻關(guān)項目(sgzjy2010005)

張巍，碩士，工程師。研究方向：森林特產(chǎn)和森林經(jīng)營。E-mail：zw81025259@163.com

張巍，王清君，郭興.紅松不同種源的遺傳多樣性分析[J].森林工程，2017，33(2)：17-21.

S 791

A

1001-005X(2017)02-0017-05