全志星，田佳源，張思宇，皇甫超河，劉紅梅，楊殿林，常泓，王慧*

不同入侵地區(qū)黃頂菊DNA 表觀遺傳多樣性變化特征

全志星1，田佳源2，張思宇2，皇甫超河2，劉紅梅2，楊殿林2，常泓1，王慧2*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191）

從黃頂菊入侵的四個(gè)典型地區(qū)——邯鄲市永年縣（HDY）、滄州市獻(xiàn)縣（CZX）、衡水市衡水湖（HSH）和天津市靜海縣（TJJ）采集植物葉片，利用甲基化MSAP技術(shù)研究黃頂菊DNA表觀遺傳和多態(tài)性變化特征以及土壤環(huán)境因子與黃頂菊整體甲基化水平之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：13對引物共擴(kuò)增出993條MSAP條帶，引物多態(tài)性百分比為88.52%。四個(gè)地區(qū)黃頂菊種群的多態(tài)性位點(diǎn)百分比較高，在84.03%～92.31%之間，遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.07，只有7%的遺傳變異存在于不同地區(qū)黃頂菊種群間，93%的遺傳變異則存在于種群內(nèi)，基因流（Nm）為3.321（＞1），表明四個(gè)不同入侵地區(qū)黃頂菊種群間存在廣泛而頻繁的基因交流。不同地區(qū)黃頂菊種群間遺傳分化不顯著，但甲基化模式差異顯著，推測黃頂菊可能通過改變甲基化水平來維持自身對新環(huán)境的適應(yīng)。MSP與MISP聚類結(jié)果表明TJJ與HDY親緣關(guān)系最近，認(rèn)為可能與兩地土壤理化因子和所處地理位置相近有關(guān)，但相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)黃頂菊甲基化水平與土壤因子之間的相關(guān)性并不顯著（P>0.01），推測地區(qū)環(huán)境對黃頂菊表觀遺傳多樣性的影響是受多重因素共同作用的結(jié)果，而非某個(gè)單一因子的作用。

黃頂菊；表觀遺傳多樣性；DNA甲基化；MSAP

黃頂菊（Flaveria bidentis）又稱二齒黃菊，屬于菊科堆心菊族黃菊屬，一年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲，是近十年來發(fā)現(xiàn)的一種新型外來入侵植物[1]。2001年在天津市和河北省衡水湖先后被發(fā)現(xiàn)，后快速擴(kuò)散。2008年河北省黃頂菊入侵現(xiàn)象尤為嚴(yán)重，入侵面積高達(dá)2萬hm2，占領(lǐng)該省的70多個(gè)縣城[2]；2006—2008年天津市黃頂菊入侵面積由200 hm2擴(kuò)散到了277.6 hm2[3]。黃頂菊具有極強(qiáng)耐鹽堿和耐干旱的特性，依靠其強(qiáng)大的繁殖能力、易于擴(kuò)散等特點(diǎn)擾亂生態(tài)系統(tǒng)原有的食物鏈和能量秩序，已被列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》[4]。

表觀遺傳學(xué)是指基于DNA或組蛋白上的共價(jià)修飾而非基因序列改變導(dǎo)致的基因表達(dá)水平的變化，這種變化具有遺傳性且遺傳是可逆的[5]。研究表明不同地區(qū)生長的植物種群間，存在較大的表觀基因組差異[6]。植物利用基因組的表觀修飾，改變相同基因型個(gè)體的基因表達(dá)式樣，通過表型可塑性來響應(yīng)環(huán)境條件的變化。

DNA甲基化是最重要的表觀遺傳修飾方式之一，也是目前機(jī)制研究最為透徹的表觀遺傳過程[7-9]。Angers等[10]發(fā)現(xiàn)，環(huán)境條件能夠誘導(dǎo)DNA甲基化變異，且環(huán)境誘導(dǎo)的DNA甲基化和表觀變異具有持續(xù)性和可遺傳性。對于植物而言，氣候條件、土壤理化性質(zhì)等可以誘導(dǎo)其表觀遺傳變異。潘麗娜[11]發(fā)現(xiàn)擬南芥通過表觀遺傳修飾能更好地適應(yīng)環(huán)境中各種脅迫（高鹽、干旱、高溫）。韓雅楠等[12]發(fā)現(xiàn)高鹽漬土壤使堿蓬和蒙古黃芪的CCGG位點(diǎn)發(fā)生大量的去甲基化現(xiàn)象?；蚪MDNA甲基化的改變很有可能是調(diào)控入侵植物生境適應(yīng)能力的重要機(jī)制之一，然而目前對黃頂菊基因組DNA甲基化的分布模式、變異情況等還缺乏全面的認(rèn)識(shí)。入侵植物黃頂菊DNA表觀遺傳多樣性是否受地理分布區(qū)域及入侵生境條件的影響，尚不清楚。Reyna-Lopez等[13]在1997年首次報(bào)道MSAP技術(shù)，MSAP技術(shù)是在AFLP基礎(chǔ)上衍生的基于PCR擴(kuò)增多態(tài)性的DNA甲基化檢測方法。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于無需知道被測DNA序列信息，通過兩組酶對CCGG酶切位點(diǎn)敏感程度不同，就可以檢測出樣品中大量的甲基化位點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于植物DNA甲基化水平的研究。目前對黃頂菊基因組序列信息沒有全面的了解，故通過甲基化MSAP技術(shù)，研究不同地理分布區(qū)域黃頂菊種群間的表觀遺傳多樣性，可為探索黃頂菊生態(tài)適應(yīng)性獲得的表觀遺傳機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物樣品采集

2015年9月5—7日分別從四個(gè)地區(qū)——河北省邯鄲市永年縣（HDY）、河北省滄州市獻(xiàn)縣（CZX）、河北省衡水市衡水湖（HSH）和天津市靜海縣（TJJ），采集處于營養(yǎng)盛期黃頂菊的第3對完全展開葉片，采集的個(gè)體之間距離不低于50 m，每個(gè)地區(qū)采集15個(gè)個(gè)體。將采集葉片用錫箔紙包裹放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱貯存。在黃頂菊葉片采集處就地采集四個(gè)典型入侵地區(qū)的土壤各15份，并用塑封袋封裝，隨后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱冰凍保存。通過實(shí)驗(yàn)測定土壤的理化指標(biāo)，重復(fù)5次并剔除差異較大的數(shù)據(jù)，取其平均值。黃頂菊采集地基本概況見表1。

1.2 基因組DNA提取

黃頂菊葉片基因組DNA采用改良CTAB法提取，參照Wang等[14]方法提取DNA并做進(jìn)一步改進(jìn)：在液氮中充分碾磨的植物樣品加入65℃預(yù)熱的CTAB裂解液[2%CTAB（W/V），0.2 mmol·L-1Tris-CL（pH 8.0），0.05 mmol·L-1EDTA（pH 8.0），1.4 mmol·L-1NaCl，2%β-巰基乙醇（V/V）1 mL，1%PVP-40（W/V）]，等體積氯仿抽提上清液后，用3 mmol·L-1KAc和異丙醇沉淀DNA，最后經(jīng)無水乙醇漂洗，加入1 mmol·L-1NaCl溶解DNA并放入4℃冰箱保存。

表1 黃頂菊采集地區(qū)基本概況Table 1 Basic situation of Flaveria bidentis acquisition area

1.3 MSAP體系建立與優(yōu)化

MSAP分析方法參照梁宏偉等[15]方法并對酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增進(jìn)行一定的優(yōu)化調(diào)整。酶切連接反應(yīng)體系（20 μL）組成成分：10×T4 DNA ligase buffer 2.5 μL，EcoRⅠadaptor（5 μmol·L-1）1 μL，HpaⅡ/MSPⅠadaptor（50 μmol·L-1）1 μL，BSA（1 mg·L-1）1 μL，HpaⅡ（或MSPⅠ）1 U，EcoRⅠ0.5 U，T4 DNA ligase 0.5 U，模板DNA 500 ng，加ddH2O補(bǔ)至20 μL。將上述溶液混勻后置入PCR儀，反應(yīng)條件為：37℃酶切6 h，接著16℃連接8h，最后65℃10min，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）組成成分：酶切連接產(chǎn)物（稀釋10倍）2.0 μL，dNTPs（2.5 μmol·L-1）1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物pre-E-A（5 μmol·L-1）1 μL，引物pre-H/M-T（5 μmol·L-1）1 μL，Taq DNA polymerase 0.5 U，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。將上述溶液混勻后置入PCR儀，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃30 s，56℃60 s，72℃60 s，最后72℃10 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

選擇擴(kuò)增體系的組成成分除引物3′末端添加2個(gè)選擇性堿基外，其余與預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系相同。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，以94℃30 s、65℃60 s、72℃60 s為一個(gè)循環(huán)，之后每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度遞減0.7℃共擴(kuò)增13個(gè)循環(huán)，接著進(jìn)行23個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45 s、55℃45 s、72℃90 s，最后72℃10 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＝宇^和引物序列見表2。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

配置5%聚丙烯酰胺凝膠電泳[16]（尿素33.6 g，5× TBE 16 mL，40%丙烯酰胺貯液10 mL，TEMED 75 μL，10%APS 320 μL，補(bǔ)水至50 mL），對選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分離。制作好的凝膠板組裝放入含有1xTBE的電泳槽中，預(yù)電泳1 h使膠面溫度達(dá)到55℃時(shí)上樣，55 W恒功率下電泳2 h。電泳結(jié)束后，剝離兩塊玻璃板，將長玻璃板上的電泳條帶進(jìn)行固定、銀染和顯色，清水沖洗后自然晾干，掃描并進(jìn)行條帶計(jì)數(shù)和分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Quantity One軟件標(biāo)記出5%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中100～500 bp區(qū)間擴(kuò)增出來的條帶，其中有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0，轉(zhuǎn)化成MSAP的表型數(shù)據(jù)0/1矩陣。利用POPGene軟件分析樣品的多樣性指數(shù)。通過NTsys軟件將0/1矩陣轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的MSP（甲基化敏感位點(diǎn)）和MISP（甲基化不敏感位點(diǎn)）聚類圖譜。用SPSS軟件進(jìn)行不同地區(qū)土壤環(huán)境因子與黃頂菊甲基化水平的相關(guān)性分析。

表2 接頭和引物序列信息Table 2 Sequence information of adaptor and primers

2 結(jié)果與分析

2.1 黃頂菊MSAP體系的建立

MSAP技術(shù)對基因組DNA質(zhì)量要求很高，模板DNA的純度直接影響后續(xù)酶切、擴(kuò)增以及MSAP譜帶的穩(wěn)定性。為滿足MSAP實(shí)驗(yàn)要求，采用改良的CTAB法提取黃頂菊葉片基因組DNA，用蛋白核酸定量測定儀檢測DNA濃度，要求模板DNA OD260/280在1.7～1.9范圍內(nèi)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，要求基因組DNA條帶清晰、無降解、無雜質(zhì)，即可用于甲基化MSAP檢測?；蚪MDNA凝膠電泳圖見圖1。MSAP體系的建立包括：酶切連接反應(yīng)、預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)和選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。

隨機(jī)選取10個(gè)黃頂菊單株樣本做模板進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過對144對引物組合進(jìn)行篩選，確定13對擴(kuò)增效果較好的引物組合。利用13對引物組合擴(kuò)增四個(gè)入侵地區(qū)共40個(gè)黃頂菊單株，40個(gè)黃頂菊單株部分引物的MSAP圖譜如圖2所示。本研究只統(tǒng)計(jì)片段長度在100～500 bp范圍內(nèi)的片段。部分泳道的量化分析如圖3所示。以第1泳道為參照，其余泳道擴(kuò)增相同分子量的條帶相似比，第7泳道與第1泳道擴(kuò)增條帶的相似度最高，為77%，而第25泳道與其相似度最低，為14.1%。

2.2 甲基化MSAP分析

統(tǒng)計(jì)不同引物組合擴(kuò)增的條帶數(shù)，結(jié)果如表3所示，13對引物共擴(kuò)增出993條MSAP條帶，平均每對引物擴(kuò)增76條。利用POPGene軟件對樣本遺傳多樣性的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析（表4），13對引物觀察等位基因數(shù)na平均值為1.885 2，有效等位基因數(shù)ne平均值為1.479 9，雜合度h平均值為0.291 0，香農(nóng)多態(tài)性指數(shù)I平均值為0.442 5。多樣性指數(shù)越高則多態(tài)性位點(diǎn)百分比也越高，13對引物獲得的993個(gè)位點(diǎn)中，多態(tài)性位點(diǎn)為879個(gè)，多態(tài)性百分比達(dá)到88.52%，表明本研究篩選獲得的13對引物組合非常適用于黃頂菊表觀遺傳多樣性的研究。引物組合EdHM6的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、雜合度、香農(nóng)多態(tài)性指數(shù)均高于平均值，表明該引物對表觀遺傳多樣性貢獻(xiàn)率最大。EbHM5多態(tài)百分比最低（僅72.73%），其多樣性指數(shù)偏低，則該引物對表觀遺傳多樣性貢獻(xiàn)率最小。由表5可知，四個(gè)入侵地區(qū)黃頂菊種群多態(tài)性位點(diǎn)百分比在84.03%～92.31%范圍內(nèi)。TJJ黃頂菊種群多態(tài)性位點(diǎn)百分比最高，為92.31%。香農(nóng)多態(tài)性指數(shù)I在0.398 1～0.492 1范圍內(nèi)，其中CZX黃頂菊種群香農(nóng)多樣性指數(shù)最高。Nei基因多樣度H在0.226 4～ 0.264 5范圍內(nèi)，其中CZX黃頂菊種群Nei基因多樣度最高。根據(jù)Nei指數(shù)計(jì)算獲得不同入侵地黃頂菊種群總基因多樣度HT均值為0.137 8，種群內(nèi)基因多樣度HS均值為0.128 1，遺傳分化系數(shù)Gst為0.07（表6）。四個(gè)不同入侵地黃頂菊種群間的遺傳變異占種群總遺傳變異的7%，表明遺傳變異主要是以相同入侵地區(qū)黃頂菊種群內(nèi)變異為主?；蛄鱊m均值為3.321＞1，說明四個(gè)入侵地的黃頂菊種群間存在廣泛的基因交流，側(cè)面印證不同入侵地區(qū)黃頂菊種群間遺傳變異不顯著。在種群遺傳變異不顯著情況下，猜測入侵環(huán)境變化誘導(dǎo)黃頂菊表觀遺傳發(fā)生變化，從而使得不同入侵地黃頂菊種群間甲基化模式改變。

圖1 黃頂菊基因組DNA提取Figure1 Extraction of the Flaveria bidentis genomic DNA

圖2 40個(gè)黃頂菊單株MSAP檢測結(jié)果Figure 2 MSAP profile of 40 Flaveria bidentis plants

圖3 部分泳道量化分析圖Figure 3 Quantitative analysis diagram of part lane

表3 所選引物組合的序列信息及擴(kuò)增條帶數(shù)Table 3 Sequence information of the selected primers and the amplified bands number

表4 引物的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis of primers

表5 四個(gè)入侵地黃頂菊種群遺傳多樣性分析Table 5 The group of Flaveria bidentis in four different invasive areas genetic diversity analysis

表6 四個(gè)入侵地黃頂菊種群遺傳分化Table 6 The group of Flaveria bidentis in four different invasive areas genetic diversity analysis

2.3 四個(gè)入侵地區(qū)黃頂菊甲基化模式和多態(tài)性分析

HpaⅡ和MSPⅠ能識(shí)別相同的酶切位點(diǎn)5′-CCGG-3′，這是真核生物中常見的甲基化位點(diǎn)。但兩者對5′-CCGG-3′位點(diǎn)內(nèi)外側(cè)胞嘧啶的敏感程度不同。因此HpaⅡ和MSPⅠ兩種酶組合切割同一份DNA能產(chǎn)生不同的甲基化模式。MSAP甲基化模式共有4種類型。類型Ⅰ：HpaⅡ和MSPⅠ都能切開，此類型DNA條帶未甲基化；類型Ⅱ：HpaⅡ能切開，MSPⅠ不能切開，此類型DNA條帶半甲基化；類型Ⅲ：HpaⅡ不能切開，MSPⅠ能切開，此類型DNA條帶全甲基化；類型Ⅳ：HpaⅡ和MSPⅠ都不能切開。

由表7可知：四個(gè)入侵地區(qū)中，HDY獲得的類型Ⅰ條帶數(shù)最多，平均785.3條；HSH獲得的類型Ⅱ條帶數(shù)最多，平均103.2條；CZX獲得的類型Ⅳ條帶數(shù)最多，平均111條；HSH和HDY獲得的類型Ⅲ條帶數(shù)最多，平均66.2條。由圖4可知HSH與TJJ甲基化狀態(tài)變化趨勢相近，CZX與HDY甲基化狀態(tài)變化趨勢相近，HSH、TJJ、CZX、HDY半甲基化和全甲基化狀態(tài)變化趨勢有顯著差異。

表7 四個(gè)不同入侵地區(qū)40個(gè)黃頂菊單株DNA甲基化類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 7 Statistics of 40 Flaveria bidentis DNA methylation types in four different invasive areas

利用Quantity One軟件獲得MSP（甲基化敏感位點(diǎn)）和MISP（甲基化不敏感位點(diǎn)）兩類表觀遺傳數(shù)據(jù)，進(jìn)一步通過NTSYS軟件繪制MSP和MISP各自的聚類圖譜（圖5和圖6）。聚類分析結(jié)果表明：四個(gè)不同入侵地區(qū)黃頂菊按照各自地理位置聚類在一起。黃頂菊種群個(gè)體間遺傳距離越小，彼此親緣關(guān)系越近。其中TJJ黃頂菊與HDY黃頂菊最先聚類在一起，說明TJJ與HDY這兩個(gè)入侵地區(qū)黃頂菊種群間親緣關(guān)系最為相近。TJJ與HDY黃頂菊種群作同一分支隨后與HSH黃頂菊聚類在一起。TJJ、HDY、HSH作為一大分支最后與CZX黃頂菊聚類在一起。說明CZX黃頂菊種群與其他入侵地黃頂菊種群在親緣關(guān)系上存在一定距離。四個(gè)不同入侵地黃頂菊MSP與MISP的聚類先后順序大致相同，說明在黃頂菊整個(gè)的種群遺傳過程中，四個(gè)不同入侵地區(qū)黃頂菊種群間沒有較大的遺傳分化。但不同入侵地黃頂菊種群間甲基化模式存在顯著差異，推測黃頂菊通過自身甲基化修飾來改變自身甲基化模式，以更好地適應(yīng)不同環(huán)境。

2.4 土壤環(huán)境因子與MSAP相關(guān)性分析

相關(guān)性分析是考察兩個(gè)變量之間線性關(guān)系的一種統(tǒng)計(jì)分析方法，可精確反應(yīng)當(dāng)一個(gè)變量發(fā)生變化時(shí)另一個(gè)變量的變化情況。利用SPSS軟件分析不同入侵地區(qū)土壤環(huán)境因子與黃頂菊甲基化水平的相關(guān)性（表8）。土壤理化因子與黃頂菊整體甲基化（或半甲基化）相關(guān)系數(shù)從大到小排序：全氮＞全磷＞pH＞銨態(tài)氮＞有機(jī)質(zhì)＞全鉀＞硝態(tài)氮。土壤理化因子與黃頂菊全甲基化相關(guān)系數(shù)從大到小為：銨態(tài)氮＞全磷＞硝態(tài)氮＞全氮＞有機(jī)質(zhì)＞全鉀＞pH。一般來說，相關(guān)系數(shù)取絕對值后，0～0.09視為沒有相關(guān)性，0.1～0.3為弱相關(guān)，0.3～ 0.5為中等相關(guān)，0.5～1.0為強(qiáng)相關(guān)。從表8可以看到黃頂菊甲基化狀態(tài)與土壤因子相關(guān)性強(qiáng)弱關(guān)系：黃頂菊整體甲基化（或半甲基化）與土壤全氮濃度、土壤全磷濃度、土壤pH最為相關(guān)；黃頂菊全甲基化則與土壤銨態(tài)氮濃度、硝態(tài)氮濃度、全磷濃度最為相關(guān)，其中與土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度為負(fù)相關(guān)關(guān)系。相關(guān)性僅僅看系數(shù)的大小是不夠的，還需要做顯著性差異檢驗(yàn)，經(jīng)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃頂菊甲基化狀態(tài)與土壤主要理化因子不存在顯著相關(guān)性（P>0.01）。推測地區(qū)環(huán)境對黃頂菊表觀遺傳多樣性的影響是受多重因素共同作用的結(jié)果，而非某個(gè)單一因子的作用。

圖4 四個(gè)不同入侵地黃頂菊甲基化狀態(tài)比較Figure 4 Comparation of Flaveria bidentis methylation status of four different invasive areas

圖5 四個(gè)不同入侵地40個(gè)黃頂菊個(gè)體甲基化敏感（MSP）位點(diǎn)的聚類分析Figure 5 Clustering analysis of 40 Flaveria bidentis methylation sensitive（MSP）loci in four different invasive areas

圖6 四個(gè)不同入侵地區(qū)40個(gè)黃頂菊個(gè)體甲基化不敏感（MISP）位點(diǎn)的聚類分析Figure 6 Clustering analysis of 40 Flaveria bidentis methylation non-sensitive（MISP）loci in four different invasive areas

3 討論

以往研究入侵植物與環(huán)境的相互作用以及物種的適應(yīng)性進(jìn)化都特別強(qiáng)調(diào)遺傳變異的作用，但事實(shí)上，植物面對環(huán)境條件的變化也可以通過表型可塑性方式做出相應(yīng)的變化來維持其適合度，使其更好地適應(yīng)環(huán)境。基因組表觀遺傳變異是環(huán)境適應(yīng)性和表型可塑性發(fā)生的重要基礎(chǔ)。Grativol等[17]發(fā)現(xiàn)，遺傳背景差異小的情況下，環(huán)境變化能夠引起植物有機(jī)體DNA甲基化的變異，且這些DNA甲基化變異影響表型形成過程?；蚪MDNA甲基化的改變很有可能是調(diào)控入侵植物生境適應(yīng)能力的重要機(jī)制之一。近年來，黃頂菊入侵的生態(tài)學(xué)機(jī)制已經(jīng)引起人們的重視，但已有研究多集中在不同環(huán)境條件下黃頂菊的種子萌發(fā)特性[18-19]、入侵途徑、傳播方式、生物學(xué)特性[20]及生理生化指標(biāo)等變化規(guī)律，對黃頂菊基因組DNA甲基化的分布模式、變異情況等還缺乏全面的認(rèn)識(shí)。因此，本文通過研究四個(gè)典型入侵地生長的黃頂菊的甲基化水平及甲基化水平與環(huán)境理化因子相關(guān)性，探究黃頂菊DNA表觀遺傳多樣性是否受地理分布區(qū)域及入侵生境條件的影響。

表8 不同地區(qū)土壤指標(biāo)與黃頂菊甲基化水平相關(guān)性分析Table 8 Correlation analysis between the soil indexes and methylation level of Flaveria bidentis

從四個(gè)不同入侵地黃頂菊Nei氏遺傳多樣性指數(shù)H來看，TJJ、HSH、HDY、CZX之間數(shù)值相近，沒有明顯的種群間遺傳分化。但四個(gè)不同入侵地區(qū)黃頂菊種群間甲基化模式差異較大，其中CZX與HDY兩地植株的各自半甲基化位點(diǎn)和整體甲基化位點(diǎn)相近，且兩者均表現(xiàn)為半甲基化位點(diǎn)高于各自全甲基化位點(diǎn)。TJJ與CZX、HSH與CZX、HSH與HDY、TJJ與HDY兩兩相互比較發(fā)現(xiàn)：前者與后者半甲基化的比值略大于2，整體甲基化的比值接近2。四個(gè)不同入侵地區(qū)黃頂菊種群間無明顯的遺傳變異情況下，不同地區(qū)黃頂菊甲基化模式卻存在顯著差異，推測是由于采樣地生境不同所致，TJJ與HSH為水生境，而CZX、HDY為陸生境。陳冬青等[21]對于不同環(huán)境下黃頂菊浸提液對多年生黑麥草萌發(fā)與生長影響的研究發(fā)現(xiàn)，黃頂菊自身化感潛力是水邊生境大于陸邊生境。采樣地生境的不同可能是導(dǎo)致黃頂菊自身甲基化模式差異的原因。

李紅巖[22]對河北省黃頂菊遺傳多樣性和遺傳分化的研究中，采用AFLP來分析河北省7個(gè)種群、4個(gè)生境下的黃頂菊遺傳多樣性，也證實(shí)了黃頂菊物種水平具有豐富遺傳多樣性，對于黃頂菊入侵初期，即使有很高的基因交流仍不能阻止黃頂菊種群遺傳分化。在遺傳漂流、地理隔離、選擇壓力下黃頂菊種群分化，種群水平遺傳多樣性差異顯著。在非適宜的環(huán)境，如光照不足、重金屬脅迫下，遺傳多樣性會(huì)持續(xù)在一個(gè)低水平；在良好的生長環(huán)境條件下，則維持在高水平。對本文采樣的四個(gè)典型黃頂菊入侵地進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，采樣地在地理位置上臨近，氣候環(huán)境偏差不顯著，但存在一定生境差異，且土壤理化因子也不同，故推測入侵環(huán)境土壤因子理化差異也可能對黃頂菊甲基化模式產(chǎn)生一定的影響。四個(gè)入侵地土壤pH、銨態(tài)氮濃度、全鉀濃度數(shù)值相近，而土壤有機(jī)質(zhì)、全氮濃度、硝態(tài)氮濃度數(shù)值卻有顯著差異，四個(gè)地區(qū)土壤全磷濃度差異不明顯。

通過分析黃頂菊甲基化模式與土壤因子相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，整體甲基化、半甲基化一致，均與土壤全氮濃度、土壤全磷濃度、土壤pH最為相關(guān)，說明全氮、全磷、土壤pH對黃頂菊整體甲基化和半甲基化模式影響大。全甲基化則與土壤銨態(tài)氮濃度、硝態(tài)氮濃度、全磷濃度最為相關(guān)，其中與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度為負(fù)相關(guān)關(guān)系。銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、全磷對全甲基化模式影響最大。通過t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性不顯著（P＞0.01），推測地區(qū)環(huán)境對黃頂菊表觀遺傳多樣性的影響是多重因素共同作用的結(jié)果，而非某個(gè)單一因子的作用。在種群間遺傳分化不顯著情況下，土壤因子差異對黃頂菊甲基化模式有一定誘導(dǎo)作用，使得黃頂菊對于不同入侵環(huán)境會(huì)通過甲基化修飾來改變自身甲基化模式，用于適應(yīng)新環(huán)境。

4 結(jié)論

四個(gè)入侵地區(qū)的黃頂菊種群間遺傳變異并不顯著，但表觀遺傳多樣性豐富且其甲基化水平差異顯著。不同環(huán)境中土壤理化因子對黃頂菊甲基化水平具有一定的影響，盡管這種影響并不顯著。推測黃頂菊通過甲基化修飾方式改變自身甲基化水平，使得黃頂菊表觀遺傳發(fā)生了變化，從而更好地適應(yīng)新環(huán)境。對不同入侵地區(qū)黃頂菊表觀遺傳變化特征的初步探究有別于以往在遺傳、生理、生化水平上的研究。這不僅從新的切入方向，即表觀遺傳水平上對黃頂菊進(jìn)行研究，也為相同或相似種屬的菊科植物表觀遺傳研究提供了參考。

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Studies on epigenetic diversity variation characteristics of Flaveria bidentis genome DNA of four different geographical distributions

QUAN Zhi-xing1,TIAN Jia-yuan2,ZHANG Si-yu2,HUANGFU Chao-he2,LIU Hong-mei2,YANG Dian-lin2,CHANG Hong1,WANG Hui2*
（1.College of Life Science,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;2.Agro-Enviromental Protection Institute,Ministry of Agriculture,Tianjin 300191,China）

We gatheredFlaveria bidentisleaves from four typical invasion areas（HDY,CZX,HSH,and TJJ）and by MSAP method DNA epigenetic diversity and polymorphism variation characteristics as well as the correlation between soil environmental factors andFlaveria bidentistotal methylation level were studied.The results showed that a total of 993 MSAP bands were amplified.There were 879 polymorphic loci in the total 993 bands and the percentage of which was 88.52%.The polymorphic loci percentage ofFlaveria bidentisspecies in four different invasion area is higher which is between 84.03%and 92.31%.Gstis 0.07 and there were 7%genetic variations between four differentFlaveria bidentisspecies and 93%of which were in species.Nmis 3.321（>1）which showed that there were extensive and frequent gene exchanges betweenFlaveria bidentisspecies.Genetic differentiation between populations was not significant,but there were significant differences in methylation patterns.We guess that theFlaveria bidentismay alter its methylation level to adapt to new environment.MSP and MISP clustering analysis showed that the relationship between TJJ and HDY was closest,which may be related to the soil factors and geographical position of two places.However,SPSS analysis showed that there were no significant correlation（P>0.01）between the methylation level and the soil factors.We speculate that the effect of environment to the epigenetic diversity ofFlaveria bidentiswas the results of multiple factors rather than a single factor.

Flaveria bidentis;epigenetic diversity;DNA methylation;MSAP

S45

A

1672-2043（2017）04-0625-10

10.11654/jaes.2016-1245

2016－09－26

全志星（1990—），女，四川成都人，碩士研究生，主要從事外來植物入侵機(jī)制研究。E-mail：2754658381@qq.com

*通信作者：王慧E-mail：wanghui03@caas.cn

國家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401811）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（青年項(xiàng)目，15JCQNJC15300）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（31401811）；Tianjin Natural Science Foundation（15JCQNJC15300）

全志星，田佳源，張思宇，等.不同入侵地區(qū)黃頂菊DNA表觀遺傳多樣性變化特征[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（4）：625-634.

QUAN Zhi-xing,TIAN Jia-yuan,ZHANG Si-yu,et al.Studies on epigenetic diversity variation characteristics of Flaveria bidentis genome DNA of four different geographical distributions[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（4）:625-634.