李榮+張建平

摘 要：該文以構(gòu)建基因ILKAP的真核表達載體及通過Western-blotting進行檢測的創(chuàng)新型試驗項目為例，利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，對在校本科生的創(chuàng)新性試驗項目的設計方案、實施及試驗結(jié)果與成效進行了探討。結(jié)果顯示，該實驗項目的實施，不僅可以培養(yǎng)學生的思維能力和創(chuàng)新意識，提高其實驗設計和實際操作的能力，而且提高了學生的主動性和團隊協(xié)作能力。

關鍵詞：現(xiàn)代分子生物學技術(shù)；創(chuàng)新性試驗；試驗教學改革

中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）08-0182-03

Abstract：Taking the experiment of “Construction of the eukaryotic expression vector of Flag-ILKAP-pCMV-2b and then detection of the expression by western-blotting in HEK293T cells” as an example，we expored the design scheme，experimantal implementations and results and analysis by the use of modern molecular biological techniques.The implementation of experiment program trained the capability and idea of innovation，foster students' experimental design and operation skills，and also enhanced the initiative and teamwork ability.

Key words：Modern molecular biology technology；Innovation experiment；Experimental teaching reform

創(chuàng)新是一個民族的靈魂，是國家綜合國力得以提高的根本，是科學技術(shù)迅猛發(fā)展的基礎。隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和時代進步，社會對高等教育提出了更高的要求，具備“創(chuàng)新精神與創(chuàng)新能力”的創(chuàng)新型人才，已成為知識經(jīng)濟時代發(fā)展的迫切需求。大學生作為最具有自主創(chuàng)新能力的社會群體，是創(chuàng)新型國家建設過程中最為積極活躍的因素，因此，激發(fā)大學生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力，是構(gòu)建“創(chuàng)新型國家”的重要組成部分[1-3]。

近年來，我國提出了建設創(chuàng)新型國家的戰(zhàn)略，開始倡導創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)，各類高等院校也在積極探索創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)方案，盡管取得了一些經(jīng)驗，但到目前為止還沒有獲得突破性的進展。創(chuàng)新能力和實踐能力的培養(yǎng)是教學改革建設的核心內(nèi)容和培養(yǎng)質(zhì)量的重要著力點。無論是培養(yǎng)應用型、復合型和拔尖創(chuàng)新型人才的本科教育，還是培養(yǎng)“高端技能型”的高職教育，學生的創(chuàng)新能力、實踐能力培養(yǎng)質(zhì)量和水平已經(jīng)成為衡量一所高校人才培養(yǎng)質(zhì)量的重要因素，直接影響著高校、區(qū)域經(jīng)濟與社會的發(fā)展[4]。但是，創(chuàng)新能力和實踐能力的培養(yǎng)不是一朝一夕就可以完成的，需要長期的積累，需要學生在實踐中充分發(fā)揮創(chuàng)新精神，從而使學生的創(chuàng)新能力和實踐能力得以和諧發(fā)展。高校試驗教學是高校教學體系中的重要環(huán)節(jié)，對培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力和實踐能力等方面起著不可替代的作用，尤其是對于生命科學這類實驗性學科更具有舉足輕重的作用[5]。但是，就現(xiàn)在的試驗教學來看還存在許多問題，按照目前的水平還不能滿足社會對創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的要求，這些問題主要體現(xiàn)在下面幾個方面：一是雖然生命科學領域，試驗技術(shù)不斷推陳出新，而試驗教學過程設備普遍陳舊，驗證手段落后，多為一些驗證性實驗，一般按照試驗指導書或黑板板書的實驗步驟進行，學生無須深思熟慮，因而不利于培養(yǎng)學生的能動性和創(chuàng)新性；二是試驗教學一般一課一題，兩人一組，甚而至于為觀摩性試驗，學生無選擇性，并且前后試驗間無任何銜接性，因而無法激勵學生的縝密的思維邏輯性[6]。

針對以上問題，筆者結(jié)合本實驗室的條件和科研優(yōu)勢，利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)構(gòu)建了基因ILKAP的真核表達載體及通過Western-blotting進行檢測的創(chuàng)新型試驗項目。該項目融合了生物化學、分子生物學、基因工程等試驗內(nèi)容于一體，學生根據(jù)試驗目的與要求，查閱相關文獻，獨立設計實驗技術(shù)路線，確定試驗方案，從而有利于學生實踐操作能力、創(chuàng)新能力和解決問題能力的鍛煉，取得了較好的試驗教學效果。

1 設計實驗項目

洞庭湖地區(qū)是日本血吸蟲的流行區(qū)域，而該區(qū)域的東方田鼠（Microtus fortis）是日本血吸蟲的非適宜宿主，也是唯一一種能感染血吸蟲但不致病具的哺乳動物。學生對該物種的這一特性產(chǎn)生了濃厚的興趣，因此在已有研究發(fā)現(xiàn)東方田鼠骨髓ILKAP基因具有一定的殺蟲特性的基礎上，學生選擇了該課題以中心法則為主線，將ILKAP基因克隆到真核表達載體pCMV-2b，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，建立ILKAP-Flag高表達的HEK293T細胞系，并通過Western-blotting來檢測其是否有表達[7]。此試驗設計涵蓋了本科階段生命科學專業(yè)的生物化學、分子生物學、基因工程、細胞生物學等一系列課程，是一個較為完整的試驗設計項目。

2 實施試驗項目

真核表達載體pCMV-2b為實驗室保存，東方田鼠購買于實驗動物中心。首先，教師向?qū)W生下達此次創(chuàng)新型項目的任務書，學生根據(jù)此任務書查找相關文獻，并設計出試驗技術(shù)路線，安排試驗進程，提出在試驗實施過程中擬解決的問題，從而提高了學生的積極性。其次，學生在試驗過程中常出現(xiàn)的問題有：不知如何設計引物，為何要在上下游引物添加酶切位點，怎樣選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶；PCR過程中不知如何設計退火溫度；進行轉(zhuǎn)染時細胞的量的估計，Western-blotting沒有設計內(nèi)參等等系列問題。因此，教師有必要先對學生的試驗設計進行指導，并要經(jīng)常進入實驗室解決學生遇到的問題，不定時檢測學生的試驗進度，同時督促學生在試驗過程中養(yǎng)成良好的原始試驗記錄習慣，以及遇到問題時如何妥善處理問題能力的培養(yǎng)。

3 試驗項目結(jié)果與分析

提取室內(nèi)封閉群東方田鼠骨髓和日本血吸蟲童蟲總RNA，用RT-PCR方法檢測ILKAP在正常生理狀態(tài)下的表達情況。RT-PCR結(jié)果顯示：ILKAP在東方田鼠骨髓和日本血吸蟲童蟲中均有表達，根據(jù)ILKAP全長酶切位點分析結(jié)果和質(zhì)粒pCMV-Tag 2b多克隆酶切位點分析，選擇Sma I和Not I作為限制性核酸內(nèi)切酶，酶切過夜，T4 DNA 連接酶16℃過夜，連接目的基因和去磷酸化處理后的空載體，重組后的質(zhì)粒經(jīng)酶切初步鑒定后，送Invitrogen公司測序驗證（圖1）。重組質(zhì)粒Flag-ILKAP-pCMV-2b構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，其中空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染作為空白對照，培養(yǎng)細胞48h后收集上清用于Western-blotting檢測。通過Western blotting，SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜后，以Flag抗體與PVDC膜共孵育，發(fā)現(xiàn)只有實驗組有條帶，而對照沒有條帶出現(xiàn)（圖2）。

在整個實驗過程中，學生遇到了很多“攔路虎”，例如在設計引物時不知如何利用生物學軟件primer和oligo相結(jié)合，原始引物設計好后沒有加酶切位點及保護堿基，其次在對目的片段進行PCR擴增時，退火溫度的摸索花了很長時間，在這個摸索的過程中學會了如何通過查閱文獻以同種屬的物種的基因克隆溫度作為參考，也學會了梯度PCR的使用；最后在用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，不知如何評估細胞數(shù)，轉(zhuǎn)染后不知何時換液，也不知是否需要添加其他試劑等等。但是學生們都找到了解決問題的方法，最終獲得了較為理想的實驗結(jié)果。

4 試驗效果

通過實驗項目的實施，學生在以下幾個方面有了較大的收獲：（1）為保證整個實驗項目的順利進行，首先得從全局著手設計實驗方案，促進學生自主的去學習課本及試驗指導書之外的知識；（2）學生通過參加科研項目，培養(yǎng)了他們的團隊協(xié)作能力，同時也提高了學生的溝通能力，項目完成后，學生還需整理相關資料和數(shù)據(jù)，完成并撰寫，為日后畢業(yè)論文的協(xié)作打下了良好的基礎；（3）試驗項目的實施極大地激發(fā)了學生的求知欲，有助于學生創(chuàng)新意思的培養(yǎng)以及獨立試驗技能的提高，同時也通過試驗結(jié)果感受到了科學探究所帶來的成就感。例如，在經(jīng)歷了western blotting的多次失敗的磨練后，到現(xiàn)在感覺只要抗體合適，幾乎就沒有他們做不出來的分子，通過系列試驗的成功，給了學生無窮的自信，使學生對生物科學產(chǎn)生了濃厚的興趣，同時也在試驗過程中感受到了成功的喜悅。（4）在試驗過程中，我們明顯感覺到學生逐步形成了發(fā)現(xiàn)問題、思考問題、解決問題的科學意識，同時分析和解決問題的能力大大加強。比如，在做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試驗時，學生做了很多嘗試來提高轉(zhuǎn)染效率。為了確保轉(zhuǎn)染在對數(shù)生長期內(nèi)進行，學生先繪制培養(yǎng)細胞的生長曲線、確定其對數(shù)生長期，然后再著手做轉(zhuǎn)染；其次在保證DNA的質(zhì)量的前提下，學生按照DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例做了曲線分析，看看reporter的表達效率，以求做到最好的轉(zhuǎn)染效率。（5）極大提高了學生的試驗操作技能。我們平時理論課和實驗課上的一些內(nèi)容例如DNA的瓊脂糖凝膠電泳，雖然理論上有強調(diào)，但實際訓練卻很少，尤其是對于大二年級的學生而言很多實驗根本就沒有開展過，創(chuàng)新實驗項目的開展，從實驗準備到試驗結(jié)果的觀察都是一個全新的體驗，學生通過一些列的的生物學試驗，提高了學生的動手操作能力，鍛煉了試驗思維，對于學生而已收獲頗豐，這是傳統(tǒng)的試驗所無法到達的試驗效果。

5 結(jié)語

高等院校生物科學專業(yè)開展創(chuàng)新型實驗是傳統(tǒng)的驗證性試驗向研究創(chuàng)新性試驗的轉(zhuǎn)變，有利于培養(yǎng)學生學習的興趣和探索科學理論的強烈欲望，能為改進實驗教學改革提供新的思路，有利于多方面、多層次、全方位地培養(yǎng)學生的素質(zhì)和能力。大學生在校期間參加科研項目，無論是對于專業(yè)知識的深入了解還是對于日后的就業(yè)問題，都有很大的益處。今后將繼續(xù)深入探索生物科學試驗教學改革、試驗創(chuàng)新意識的培養(yǎng)和試驗技能的提高三者之間的相互整合，以利于創(chuàng)新型、應用型的復合型人才的培養(yǎng)。

參考文獻

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（責編：張宏民）